肺癌細胞中PIK3AP1基因表達變化及其過表達對細胞增殖、侵襲、遷移的影響

杜瑋，黃秋敏，嚴飛

天津醫科大學，天津300070

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，根據病理類型可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中小細胞肺癌雖然所占比例不高(約15%)，對放化療敏感，但其惡性程度高，生長迅速，治療后極易復發或出現遠處轉移[1]。近年來，免疫檢測點抑制劑為小細胞肺癌的治療提供了新的方法，然而對于小細胞肺癌特異的免疫治療靶點目前仍不清楚[2]。PIK3AP1基因編碼的蛋白為BCAP，最初被鑒定為B細胞中與PI3K的p85亞基結合的一個適配器分子，通常表達于B細胞、NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，但不表達于T細胞和肥大細胞[3～7]。PIK3AP1對B細胞成熟、增殖以及免疫球蛋白的產生具有重要作用，當B細胞受體與配體結合后，在PIK3AP1中YXXM基序上的酪氨酸進行磷酸化，磷酸化的PIK3AP1與PI3K結合并誘導激活下游的AKT蛋白磷酸化，進而調控下游靶基因表達[8～10]。但在巨噬細胞和NK細胞中，PIK3AP1則成為了炎癥的負調控因子，通過Toll樣受體(TLRs)和NK細胞受體抑制細胞成熟并促進細胞凋亡。有研究顯示，PIK3AP1與肺癌的發生發展相關[11]，然而對其在肺癌中的表達情況及作用機制目前尚不清楚。2017～2020年，我們觀察了非小細胞肺癌和小細胞肺癌中PIK3AP1基因的表達情況，分析PIK3AP1基因表達水平與肺癌患者預后的關系，并觀察PIK3AP1基因過表達對肺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人支氣管上皮細胞系HBEC，人非小細胞肺癌細胞系A549、HCC827、H358，人小細胞肺癌細胞系H69、H526、H82，人腎上皮細胞系293T，均購自美國ATCC細胞庫。胎牛血清購自以色列BI公司；DMEM、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；305慢病毒過表達載體；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；Transwell小室、Matrigel膠購自美國Corning公司；逆轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司；PCR引物由中國金唯智公司合成；抗AKT抗體、抗p-AKT抗體購自美國CST公司、抗β-actin抗體購自美國Millipore公司，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購自中國Abclonal公司。

1.2 不同類型肺癌細胞中PIK3AP1 mRNA表達檢測

1.2.1 細胞培養 HBEC細胞培養于含40 μg/mL內皮細胞生長添加物(ECGS)、10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，A549、HCC827、H358、H69、H526、H82細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基。置于37 ℃、5% CO2的培養箱，待細胞貼壁后，融合度約90%時，加入胰酶消化，按照1∶3比例傳代。

1.2.2 細胞PIK3AP1 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。用TRIzol試劑提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒將RNA逆轉為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增引物序列：PIK3AP1上游5′-ATCACCCGAAGACAGAGAGA-3′，下游5′-GGTAACCTCAGGGACTTCATTATC-3′；GAPDH上游5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。PCR反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個循環。取PCR擴增產物，常規行瓊脂糖凝膠電泳，Image J軟件觀察電泳條帶的亮度。以GAPDH為內參，計算各類型細胞中PIK3AP1 mRNA的相對表達量。相對表達量<0.1為不表達，0.1～0.5為低表達，>0.5為高表達。

1.3 肺癌組織中PIK3AP1 mRNA表達與患者預后的關系分析 采用KMplot數據庫(http://kmplot.com/analysis/)。該數據庫包括基因表達綜合數據庫(GEO)來源的1 880例肺癌患者的PIK3AP1 mRNA表達以及臨床隨訪信息，采用Kaplan-Meire法繪制生存曲線，由PIK3AP1探針(Affymetrix ID 1554508_at)進行預測，組間比較采用Log-Rank檢驗。

1.4 PIK3AP1過表達對肺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響觀察

1.4.1 305-PIK3AP1質粒的構建 以小細胞肺癌的cDNA為模板，PCR擴增PIK3AP1的cDNA，引物上加入BamH Ⅰ酶切位點，上游引物5′-TTGGATCCGCCACCATGGCAGCCTCAGGG-3′，下游引物5′-TTGGATCCTCAGCGTCCTCTGGGTGGAA-3′。PCR反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30個循環。使用膠體收試劑盒對擴增片段進行回收，用限制性內切酶BamH Ⅰ酶切回收的DNA，并連接到305載體上，經測序后獲得正確的克隆。

1.4.2 病毒制備與感染 取293T細胞，培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，至細胞融合度80%。棄上清，加入不含血清的DMEM培養基。將輔助質粒Rev(2.5 μg)、VSVG(3 μg)、Pmdl(5 μg)與目的質粒305-PIK3AP1或305-empty(12 μg)混合，加入DMEM培基至500 μL。取60 μL PEI轉染試劑，與DMEM培養基混合至500 μL。將質?；旌弦号c轉染試劑混合液充分混勻，加入293T細胞中作用4 h。棄上清，換成含10%胎牛血清的DMEM培養基。轉染后24、48、72 h收集細胞上清液，用0.45 μm的濾器過濾，即為制備的病毒。

1.4.3 細胞分組與感染 取不表達PIK3AP1的肺癌細胞，培養至細胞融合度60%～70%時，棄培養液，分為觀察組和對照組。觀察組加入305-PIK3AP1病毒，對照組加入305-empty病毒，培養12 h后更換為正常培養基，感染2～3次。

1.4.4 細胞增殖能力觀察 采用BrdU法。收集兩組細胞，加入胰酶消化，制備細胞懸液，調整細胞密度為1.5×104/mL，按100 μL/孔加入96孔板，培養24 h?？装逯屑尤?0×BrdU溶液孵育6 h。棄上清，加入FixDenat溶液，室溫反應30 min。去掉上清，加入100 μL檢測抗體溶液，室溫反應2 h，Washing Buffer洗3次；加入100 μL底物，室溫反應30 min；加入H2SO4終止反應。上酶標儀，于450 nm波長處檢測吸光度(A)值。

1.4.5 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell實驗。收集兩組細胞，用0.1% FBS的培養基重懸，調整細胞密度為1×106/mL。將其接種到Matrigel包被的Transwell小室上層，每孔加入100 μL，小室下層放入完全培養基，生長24 h后用棉簽擦去Transwell中的Matrigel，對Transwell底部或小室下層的細胞進行計數。

1.4.6 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。收集兩組細胞，加入胰酶消化，制備細胞懸液，調整細胞密度為5×105/mL，按100 μL/孔接種于24孔板內。待細胞長至融合度80%以上，用黃色槍頭在每孔中垂直劃線，觀察0、24 h劃痕愈合情況并拍照。采用Image J軟件計算劃痕寬度，計算細胞遷移率。細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.4.7 細胞PI3K/AKT通路相關蛋白AKT、p-AKT蛋白檢測 采用Western blotting法。收集兩組細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，用10%的SDS-PAGE膠進行電泳分離。300 mA恒流轉膜，室溫封閉1 h。5%脫脂牛奶稀釋AKT抗體(1∶1 000)、p-AKT抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶5 000)。加入稀釋后的一抗，4 ℃過夜。加入稀釋的二抗，室溫孵育2 h。洗滌3次后，利用GE的Imager 600凝膠成像系統進行顯影。采用Image J軟件分析待測蛋白條帶灰度值，以目標蛋白與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 不同類型肺癌細胞中PIK3AP1 mRNA表達比較 PIK3AP1 mRNA在HBEC、A549細胞中的相對表達量分別為0.04±0.00、0.09±0.00(不表達)，在HCC827、H358中的相對表達量分別為0.33±0.01、0.19±0.00(低表達)，在H69、H526、H82中的相對表達量分別為0.57±0.02、0.87±0.01、0.72±0.04(高表達)。

2.2 肺癌組織中PIK3AP1 mRNA表達與患者預后的關系 1 880例患者中，PIK3AP1 mRNA高表達者的中位生存期為60.73個月，PIK3AP1 mRNA低表達者的中位生存期為92.63個月，兩組比較差異有統計學意義(HR=1.46，P<0.05)。見圖1。

圖1 肺癌組織中PIK3AP1 mRNA表達的Kaplan-Meier plotter生存分析結果

2.3 PIK3AP1過表達對A549細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響觀察結果

2.3.1 兩組細胞增殖能力比較 對照組和觀察組的A值分別為1.24±0.122、1.52±0.15。觀察組細胞增殖能力高于對照組(P<0.01)。

2.3.2 兩組細胞侵襲能力比較 對照組和觀察組的穿膜細胞數分別為(88±13)、(201±23)個。觀察組穿膜細胞數多于對照組(P<0.01)。

2.3.3 兩組細胞遷移能力比較 對照組在24 h時的細胞遷移率為37.45%±1.48%，觀察組為39.10%±2.26%。兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3.4 兩組AKT、p-AKT蛋白表達比較 對照組和觀察組p-AKT蛋白相對表達量分別為0.37±0.02、1.01±0.10，觀察組高于對照組(P<0.05)。兩組AKT蛋白相對表達量分別為1.23±0.15、1.31±0.13，兩組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

小細胞肺癌是最致命的惡性腫瘤之一，屬于神經內分泌肺癌，支氣管肺樹是最常見的原發部位，5年存活率小于7%。與非小細胞肺癌相比，小細胞肺癌具有較高的轉移能力和增殖能力，且耐藥后極易復發[12]。因此，尋找小細胞肺癌診斷和治療的潛在分子標志物是目前亟待解決的問題。

PIK3AP1是B細胞受體和CD19下游PI3K/AKT信號轉導通路的適配器，能與PI3K的p85亞基結合。該蛋白包含許多潛在的蛋白質-蛋白質相互作用結構域，但不包含任何酶催化結構域。通過蛋白質之間的相互作用，PIK3AP1可以協調受體和非受體酪氨酸激酶下游的多個細胞內信號。正常生理條件下，PIK3AP1主要在血細胞中發揮功能。缺失PIK3AP1主要表現為外周B細胞群的缺陷，脾臟中B細胞總數減少，并出現未成熟表型，即IgMhighIgDlow比例增多，IgMlowIgDhigh比例減少[10]。因此，PIK3AP1對于B細胞發育和活化是不可缺少的。除了B細胞，PIK3AP1還在NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞中表達。PIK3AP1敲除小鼠的NK細胞表現出增強的殺傷細胞能力，產生更多的干擾素γ(IFN-γ)，對細胞凋亡具有更強的抵抗力，并且更容易達到完全成熟的狀態[3]。這表明PIK3AP1對NK細胞的發育和成熟具有負向調節作用。PIK3AP1缺失的巨噬細胞展現出增強的TLR誘導的TNF、IL-6、IL-12 p40[4,5]，說明該基因抑制了巨噬細胞的功能。Chu等[6]報道，與野生型小鼠相比，PIK3AP1基因缺失的小鼠給予TLR9拮抗劑后，血清中產生較少的IFN-α，漿細胞樣DC中PIK3AP1能夠通過TLR7/9信號轉導促進IFN-α的產生。經典DC中的PIK3AP1缺乏會導致PI3K/AKT信號的激活降低，以及TLR4激活后的MyD88依賴的NF-κB信號激活的延長[7]。這些矛盾的結果表明，PIK3AP1以細胞類型特異性方式發揮不同的作用。此外，Sinclair等[13]報道，PIK3AP1基因在B細胞急性淋巴細胞白血病(B-ALL)的患者中發生缺失突變，說明該基因與B-ALL的發生發展密切相關。在實體腫瘤中，有研究表明PIK3AP1基因的突變與肺癌、頭頸癌的進展相關[14,15]，說明該基因在實體腫瘤的發生發展中也起到了重要作用。

本研究結果顯示，在具有高轉移能力的小細胞肺癌細胞中PIK3AP1 mRNA呈高表達，而在非小細胞肺癌細胞和正常支氣管上皮細胞中則不表達或低表達。Kaplan-Meier生存分析顯示，PIK3AP1基因高表達預示肺癌患者較差的預后。在不表達PIK3AP1的A549細胞中過表達PIK3AP1基因，發現PIK3AP1過表達能夠促進A549細胞的增殖和侵襲能力，但不影響細胞遷移能力。這表明PIK3AP1過表達的細胞具有較高的侵襲能力和增殖能力，而這正是小細胞肺癌的特征。因此推測，PIK3AP1基因促進了肺癌的進展，并可能成為小細胞肺癌治療的新靶標。

PI3K/AKT信號通路在多種腫瘤中被異常激活，并通過調控下游靶基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。Ⅰ型PI3K蛋白是由催化亞單位p100和調節亞單位p85所組成的異源二聚體蛋白。正常生理條件下，PI3K被募集于細胞表面生長因子受體或連接蛋白的SH2區域，并結合于受體或連接蛋白保守的磷酸酪氨酸殘基上，引起二聚體構象改變而被激活。激活的PI3K在質膜上產生第二信使PIP3，PIP3與細胞中具有PH結構域的信號蛋白PDK1和AKT募集到細胞膜上，促使PDK1磷酸化AKT蛋白。AKT一旦被激活，可以介導多個靶點的活化和抑制，通過多種機制促進細胞的存活、生長和增殖[16，17]。Zhang等[18]報道，胃癌中PIK3AP1表達顯著上調，并通過PI3K/AKT通路調節胃癌的生長和化療抵抗。本研究發現，PIK3AP1過表達的A549細胞中p-AKT顯著上調，而總AKT無明顯變化,說明在肺癌細胞中高表達的PIK3AP1也能激活PI3K/AKT信號通路，進而促進肺癌細胞的增殖和侵襲。提示PIK3AP1可能在多種腫瘤中表達上調，通過激活PIK3/AKT信號通路來促進腫瘤進展。

綜上所述，PIK3AP1基因在肺癌細胞中的表達高于正常支氣管上皮細胞，尤其在轉移能力強的小細胞肺癌細胞中高表達，并與患者較差的預后相關；PIK3AP1在肺癌中能夠激活PI3K/AKT通路，促進細胞的增殖和侵襲，但對細胞的遷移無明顯影響。PIK3AP1有可能成為肺癌診斷、靶向治療和預后評估的生物標志物。