枝睪闊盤吸蟲涼山分離株18S rRNA基因部分序列測定與種系發育分析

郝桂英，易 利，鄧 宇，何學謙

（西昌學院動物科學學院，西昌 615013）

枝睪闊盤吸蟲（Eurytrema cladorchis）隸屬于吸蟲綱（Trematoda）、復殖目（Digenea）、雙腔科（Dicrocoeliidae）、闊盤屬（Eurytreama）[1]，在牛、羊胰腺胰管內均有寄生，但不如胰闊盤吸蟲（E. pancreaticum）、腔闊盤吸蟲（E.coelomaticum）常見[2]。牛、羊感染后可引起消瘦、生長發育受阻、生產性能降低等，嚴重感染時可引起牛、羊死亡，給養殖業造成一定的經濟損失。

根據形態學特征可以對枝睪闊盤吸蟲進行初步鑒定，但由于受宿主、環境等多種因素的影響，其準確性、可靠性受到一定的限制。DNA技術已被廣泛應用于寄生蟲的分類學研究，其中DNA序列分析由于操作簡單、結果準確可靠、提供的信息豐富，成為研究分類學和種系發生學的有力工具之一[3]。

核糖體DNA（rDNA）基因具有高度保守性，在所有細胞生物中都存在，進化具有良好的時鐘性質，其序列中不同位置上變化的速度不同。18S rRNA 基因是真核生物染色體上編碼核糖體小亞基RNA的基因，該基因序列高度保守，常用來分析物種系統進化關系[4]。目前已廣泛應用于寄生蟲分子分類研究，如雞球蟲[5]、兔球蟲[6]、馬梨形蟲[7]等。用于胰闊盤吸蟲和腔闊盤吸蟲分子分類的靶基因主要有18S rRNA[8-10]、ITS2[10]，已有胰闊盤吸蟲核糖體DNA全序列的報道[11]。但關于枝睪闊盤吸蟲分子分類的研究僅見孟加拉共和國瘤牛源枝睪闊盤吸蟲18S rRNA和ITS2的報道[12]。

鑒于此，本研究對采自四川省涼山彝族自治州的9個山羊源枝睪闊盤吸蟲樣品的18S rRNA基因部分序列進行PCR擴增和序列分析，并構建枝睪闊盤吸蟲與其他吸蟲的種系發育關系，從而明確18S rRNA基因能否成為枝睪闊盤吸蟲理想的遺傳標記，為今后枝睪闊盤吸蟲的分子分類和種群遺傳結構研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲體的采集及保存枝睪闊盤吸蟲樣品采自四川省涼山彝族自治州自然感染的9只山羊胰管內，用滅菌生理鹽水清洗干凈，進行形態學鑒定后，分別編號為LS01～LS09，于-20℃保存備用。分離自同一只山羊的枝睪闊盤吸蟲為1個分離株。

1.2 主要試劑蛋白酶K購自Merck公司，2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker、GreenView核酸染料、柱式DNA膠回收試劑盒等均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 枝睪闊盤吸蟲蟲體總DNA提取從冷凍保存的9個山羊源枝睪闊盤吸蟲樣品中分別隨機取出1條，用剪刀剪碎并研磨，加入SDS（1 μg/μL）裂解液和蛋白酶K（10 μg/μL），放入56℃水浴鍋中消化過夜，然后將消化好的蟲體懸液用酚/氯仿法[13]提取蟲體總DNA，保存于-20℃備用。

1.4 枝睪闊盤吸蟲18S rRNA基因的擴增及序列測定用Zheng等[9]報道的引物進行枝睪闊盤吸蟲18S rRNA基因部分序列的擴增。引物序列分別為18SP1：5'-GGCTCATTAAATCAGCTGGTT-3'；18SP2：5'-ACGTTTTACTTCCTCT AAAT-3'。引物序列由上海杰李生物技術有限公司合成。

PCR擴增體系為50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，引物18SP1、18SP2（10 pmol/L）各2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。同時，以ddH2O作空白對照。擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，55℃復性45 s，72℃延伸110 s，35個循環；72℃延伸6 min。反應結束后分別取5 μL PCR擴增產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統檢測目的條帶的大小。各PCR擴增產物經柱式DNA膠回收試劑盒進行回收純化后送上海杰李生物技術有限公司測序。

1.5 序列分析及系統進化分析檢索GenBank收錄的部分吸蟲18S rRNA基因序列并下載（表1），然后用Clustal X 1.81軟件進行序列比對，MEGA 5.0軟件分析堿基組成、轉換/顛換比率，基于K2P模型計算遺傳距離。用DNAStar 中的MegAlign程序進行序列同源性分析。用DnaSP 4.0軟件計算單倍型數（haplotypes，H）、核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，Pi）、單倍型多樣性（Haplotypes diversity，Hd）和平均核苷酸差異（average number of nucleotide differences，K）。

以豬帶絳蟲（Taenia solium，DQ157224）作為系統發育分析的外群，采用K2P模型，用MEGA 5.0軟件構建NJ樹，并進行重復1000次的自舉檢驗（bootstrap test）。

表1 部分吸蟲18S rRNA基因序列信息Table 1 Sequences information of 18S rRNA gene of different flukes

2 結果與討論

2.1 枝睪闊盤吸蟲18S rRNA基因的序列特征和同源性比較經比對校正剔除多余序列后，本研究測得的9個枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株的18S rRNA基因部分序列長度均為1758 bp，A+T堿基的平均含量為47.8%，低于肉牛源胰闊盤吸蟲齊齊哈爾分離株18S rRNA基因全序列（1996 bp）A+T堿基的平均含量（49%～49.1%）[11]，也與斜睪亞目吸蟲18S rRNA基因序列A+T堿基的平均含量（48.18%～49.23%[17]）的結果不一致，這可能與序列長度、宿主、地理位置等有關。9個測序序列均不存在堿基插入/缺失，其中保守位點1753個，變異位點5個（簡約信息位點1個、單變異位點4個）。核苷酸變異位點發生在密碼子的第三位（占60%）和第一位（占40%）。序列中顛換多于轉換，轉換/顛換（R）平均值為1.064，3個顛換（2個G-C、1個T-G）和2個轉換（C-T）。

9個枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株測序序列的核苷酸同源性為99.9%～100%，堿基變異率為0～0.1%。9個測序序列與已知枝睪闊盤吸蟲的同源性最高（99.7%～100%），與鹿前后盤吸蟲的同源性最低（92.6%～92.7%），與胰闊盤吸蟲的同源性為99.4%，與腔闊盤吸蟲的同源性為99.1%～99.2%，與矛形雙腔吸蟲的同源性為97.9%～98.0%，與東方雙腔吸蟲、分葉短腺吸蟲的同源性均為98.0%～98.1%，與愁體吸蟲的同源性為98.5%～98.6%，與華支睪吸蟲的同源性為93.9%～94.0%，與肝片吸蟲、大片吸蟲的同源性為92.9%～93.0%。9個測序序列與枝睪闊盤吸蟲、胰闊盤吸蟲、腔闊盤吸蟲的堿基差異分別為0～0.3%、0.6%、0.8%～0.9%，與愁體吸蟲、分葉短腺吸蟲、矛形雙腔吸蟲、東方雙腔吸蟲的差異分別為1.4%～1.5%、2.0%、2.0%～2.1%和2.0%，與其他學者的報道稍有差異。鄭亞東等[8]報道腔闊盤吸蟲18S rRNA基因部分序列與愁體吸蟲、矛形雙腔吸蟲的差異分別為1.75%、2.42%。安徽省和福建省腔闊盤吸蟲和胰闊盤吸蟲的18S rRNA基因序列分別有3個和4個堿基的差異[18]。巴西牛源的3個腔闊盤吸蟲18S rRNA基因片段（528 bp）核苷酸同源性為100%，與腔闊盤吸蟲中國分離株、胰闊盤吸蟲中國分離株的同源性分別為99.8%和99.4%[19]；5個肉牛源胰闊盤吸蟲齊齊哈爾分離株的18S rRNA基因全序列（1996 bp）的堿基變異為0～0.2%[11]。因此，18S rRNA基因可以作為闊盤屬吸蟲分子分類理想的遺傳標記基因。

2.2 遺傳多樣性分析9個山羊源枝睪闊盤吸蟲18S rRNA基因序列共檢測到3個單倍型，遺傳距離為0～0.003，平均遺傳距離為0.001。與已知枝睪闊盤吸蟲參考序列的遺傳距離為0～0.001，與胰闊盤吸蟲的遺傳距離為0.005～0.006，與腔闊盤吸蟲的遺傳距離為0.008，與矛形雙腔吸蟲、東方雙腔吸蟲、分葉短腺吸蟲的遺傳距離為0.019～0.020，與愁體吸蟲的遺傳距離為0.014～0.015，與華支睪吸蟲、肝片吸蟲、大片吸蟲、鹿前后盤吸蟲的遺傳距離≥0.062。堿基序列總的單倍型多樣性（Hd）和核苷酸多樣性（Pi）分別為0.417和0.00073，平均核苷酸差異（K）為1.278?？梢娭ΣG闊盤吸蟲涼山州分離株的變異程度較低。

2.3 系統發育分析基于18S rRNA基因部分序列（1447 bp）構建的NJ樹顯示：9個山羊源枝睪闊盤吸蟲涼山州分離株與瘤牛源枝睪闊盤吸蟲孟加拉共和國分離株親緣關系最近，聚在同一小支上；然后與牛源胰闊盤吸蟲福建分離株、牛源腔闊盤吸蟲福建分離株聚類形成闊盤屬分支，再與愁體吸蟲聚為一支，分葉短腺吸蟲與雙腔屬的矛形雙腔吸蟲、東方雙腔吸蟲聚在另一小支上。從圖1可看出闊盤屬與愁體吸蟲的親緣關系最近，而分葉短腺吸蟲與雙腔屬的親緣關系更近。與其他學者報道的結果相似，Figueira等[19]基于18S rRNA基因片段（528 bp）構建的系統發育樹顯示3個巴西分離株與腔闊盤吸蟲、胰闊盤吸蟲和愁體吸蟲聚在同一支上，且與腔闊盤吸蟲和胰闊盤吸蟲的親緣關系更近，與矛形雙腔吸蟲和東方雙腔吸蟲親緣關系遠，與大片吸蟲的親緣關系最遠。常巧呈等[10]基于18S rRNA基因的部分序列（1200 bp）構建的系統發育樹證實闊盤屬和雙腔屬的親緣關系密切。Su等[11]基于18S rRNA基因全序列構建的系統發育樹顯示胰闊盤吸蟲位于斜睪亞目雙腔科的分支上，與后睪亞目的親緣關系最近，與傳統形態學分類結果一致。

本研究對采集自涼山州山羊源的枝睪闊盤吸蟲18S rRNA基因的部分序列進行PCR擴增和序列分析，結果發現涼山州枝睪闊盤吸蟲18S rRNA基因存在一定程度的遺傳變異，但遺傳變異較低。研究結果進一步支持了18S rRNA基因是復殖目吸蟲分類鑒定的理想分子標記。

圖1 基于18S rRNA基因部分序列采用NJ法構建的枝睪闊盤吸蟲系統發育樹（支持率標注在分支上）Fig.1 Phylogenetic tree of E. cladorchis based on partial sequences of 18S rRNA gene by NJ method（Numbers on the branches indicated the supporting value）