油后免膜直播棉苗期病害發生及病原分析

李彩紅，劉冰蕾，李 飛，梅正鼎，郭莉莉，何叔軍，張志剛，趙瑞元

(湖南省棉花科學研究所，湖南常德 415101)

0 引 言

【研究意義】近年來棉花生產輕簡化及綠色化成為洞庭湖棉區的發展趨勢，免膜直播逐漸成為一種新的生產模式。但洞庭湖棉區5～6月連續陰雨天氣較多，直播后往往引起棉花苗期病害大面積發生，每年都有因爛種、爛芽、死苗導致大面積補種、毀種和重播,苗期病害亦可間接誘發中后期病害及鈴病的發生，嚴重影響棉花的優質高產[1]。研究油后免膜直播棉苗期病害發生的氣候影響因子及致病原，對于針對性防控棉花苗期病害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】棉花苗期病害是一種復合性病害，在我國通常認為其發病類型主要有立枯病、炭疽病、疫病、褐斑病、猝倒病、紅腐病等[2-8]，各棉區因氣象因素、土壤質地及地勢、種植模式的影響，苗期病害種類及致病菌各有不同。目前對于苗期病害大多數為概括性報道且年限較早，普遍認為長江流域棉區苗床上主要為炭疽病[9]?！颈狙芯壳腥朦c】隨著湖南免膜直播模式的逐步推廣，有必要對油后直播棉的主要氣候影響因子及引起苗期病害發生的病原種類進行鑒定。研究油后免膜直播棉苗期病害發生及病原分析?！緮M解決的關鍵問題】結合氣象資料分析苗期病害發生與氣候因子的關系，研究苗期病害大發生流行的氣象條件；同時從致病菌入手，通過病原種類鑒定，分析湖南免膜直播棉田引發苗期病害發生的病原種類。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試品種：湘K25，由湖南省棉花科學研究所育種二組提供。

自動氣象站：型號PH，購自武漢新普惠科技有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊膠培養基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉24 g，水1 000 mL，pH值自然。將馬鈴薯洗凈后去皮，稱量200 g切碎，加水適量煮沸20～30 min，用紗布過濾后，濾液中加入葡萄糖和瓊脂繼續加熱攪勻，稍冷卻后加水補足1 000 mL，分裝到錐形瓶，加塞包扎后120℃滅菌20 min。

Czapek液體培養基：硝酸鈉2 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、磷酸氫二鉀1 g、蔗糖30 g，加水定容至1 000 mL，pH調整至7.0，然后分裝到錐形瓶，加塞包扎后120℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 苗期病害發生調查

試驗地設在湖南省棉花科學研究所常德鼎城科研基地，試驗地前茬為油菜，土質為粘土，土地平整，田間管理條件一致。小區隨機排列，行長10 m，2行區，3次重復。人工開溝直播，每小區定量播種200粒，開始出苗后每2～3 d調查1 次死苗數和出苗數，至不再有棉苗死亡時調查結束。2016 年播種時間為5 月11 日，2019年為5月22日。試驗期間日平均氣溫及日降水量數據來自試驗地自動氣象站。

1.2.2 病原菌分離與純化

于苗期病害發生期采集發病嚴重的病苗，采用常規組織分離法分離病原菌。具體方法：于超凈工作臺中，用無菌剪刀剪取病斑與病健交界處的莖葉，放入75%乙醇中浸泡3～5 s后，置于次氯酸鈉中浸泡50 s，接著用無菌水清洗3次，剪成3 mm的小塊。將小塊部位接種于PDA培養基上，25℃恒溫培養箱中培養。待菌絲長出后，按稀釋平板法獲取單孢菌株，并于超低溫冰箱保存。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 培養特性

將所得病原菌在PDA 培養基上25℃恒溫倒置培養7 d 后，觀察菌落形態、菌絲生長及孢子形態等。

1.2.3.2 分子生物學鑒定

將分離得到的病原菌在PDA 培養基上25℃恒溫倒置培養7 d 后收集菌絲，采用CTAB法提取菌株的DNA。以通用引物ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')和ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')進行聚合酶鏈式反應(Polymerasechain reaction，PCR)擴增。引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。

PCR 反應體系為：10×Taqbuffer2.5 μL(Mg2+pLus)，dNTP Mixture 2 μL，引物ITS4和ITS5各1 μL，模板1 μL，TaqDNA PoLymerase 1U ，ddH2O補足至25 μL。

PCR 反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性50 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，進行35 個循環，最后72℃延伸10 min，4℃保存。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶的大小和有無，將PCR 擴增產物送至蘇州金維智生物科技有限公司測序。

1.3 數據處理

數據統計采用Microsoft office Excel 2010；測序的拼接結果在NCBI 上進行BLAST 比對，根據比對結果，構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 苗期病害發生

研究表明，2016年5月11日棉花播種后，于5月15日出現第1次降雨(9.3 mm)，5月23日開始有死苗出現，平均死苗數為1.3，5月25日和5月31日呈現2次死苗高峰，平均死苗數分別為4.0和5.3，期間日均溫分布在17.2～28.3℃，降雨總量為183.8 mm。2019年湖南上半年低溫陰雨天氣持續不斷，油菜收獲較往年偏晚，棉花5月22日播種，5月25日出現第1次降雨(6.2 mm)，6月3日出現第1次死苗，死苗數為30，為本年度死苗最高峰，6月10日出現第2次死苗小高峰，死苗數為9.7，試驗期間日平均氣溫分布在21.1～28.3℃，降雨總量為251.6 mm，2019年棉花直播后，日均氣溫高于2016年，但降水量大，空氣濕度大，土壤濕度較大，苗期病害發生較2016年偏重。表1

表1 試驗地日降雨量、日均溫及死苗情況Table 1 Dailyprecipitation，mean temperature and seedling diseases in test fields

2.2 病原菌

采集病株分離純化，共得到53個菌株。通用引物ITS4/ITS5 PCR擴增得到大小約550 bp的rDNA-ITS基因片段，將測序得到的基因序列在NCBI網站上進行BLAST比對分析，同時結合形態學觀察，分離到的53個菌株被鑒定為鐮刀菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、絲核菌屬和附球菌屬等共5類。其中，T9、M1、M52、M53等21株屬于鐮刀菌屬，占分離到菌株總數的39.6%，鏈格孢屬菌株17株，包括T5、M9等，占總株數的32.1%，曲霉屬11株，如M17等，占總株數的20.7%，絲核菌屬如M1～15和附球菌屬分別為3株和1株，占分離菌株的5.7%和1.9%。圖1

圖1 部分菌落形態及菌絲、孢子形態Fig.1 Culture characteristics of some strains

M53、M52與登錄號GU724513.1 (Fusariumoxysporum)一致性為99.81%，與登錄號KX196807.1 (Fusariumoxysporum)一致性為100%；T9與登錄號GU724513.1 (Fusariumoxysporum)和登錄號KX196807.1 (Fusariumoxysporum)一致性均為99.62%；M2、M31、M1～15與登錄號FJ746938.1(Rhizoctoniasolani)一致性分為99.28%、98.71%、99.86%，與登錄號 KJ866423.1(Rhizoctoniasolani)一致性分為99.28%、98.71%、99.86%。圖2

圖2 部分菌株的18S rDNA 系統發育樹Fig.2 Phylogenetic trees of partial strains based on 18S rDNA

3 討 論

引發苗期病害的因素主要包括棉苗本身的抗病性、氣候條件和菌源[9]。棉花苗期為營養生長期，影響棉苗生長的主要環境因素有溫度、降水和光照，春季低溫多雨，尤其4～5月寒潮來襲，田間濕度大，會加重苗期病害的發生[10-13]。油后免膜直播模式為油菜收貨后播種棉花，播種時間通常在5月10日以后，此時已到春末夏初，氣溫較高，有利于棉苗生長，降水量成為影響該模式下棉花苗期病害發生的最重要因子之一，播種后水量多，空氣和土壤濕度較大，就會使棉花苗期病害嚴重發生。研究探討了降雨量與苗期病害發生的關系，即出苗后20 d內是棉苗易受病原菌侵染的時期，病害主要在距播種后第1次降雨1周左右的時間開始發生，持續20 d左右，且大降雨后1周為發病高峰期，應特別做好苗期病害的防控工作，如可通過播前種子包衣、噴施植物誘導免疫劑等措施減輕病害的發生。

我國長江流域棉區春季多雨，病苗率高達90%，以根腐為主的死苗率達20%～30%，根據以往調查，長江流域棉區主要為營養缽育苗移栽方式，苗期病害以炭疽病發生最為普遍，立枯病和紅腐病次之[9]。關于油后免膜直播方式下的苗期病害病原發生尚未開展相關研究工作。研究分離獲得53個菌株，分屬于鐮刀菌屬、鏈格孢屬、曲霉屬、絲核菌屬和附球菌屬等。鐮刀菌是一類重要的土傳病原真菌，其中尖孢鐮刀菌可侵染棉苗引發枯萎??；串珠鐮刀菌、木賊鐮刀菌等可引起棉苗紅腐??；立枯絲核菌可誘發棉苗立枯??；鏈格孢菌可導致棉苗黑斑病[14-19]。關于曲霉菌，趙麗紅等報道在棉花種子帶菌檢測中發現了黃曲霉[20]，曲霉屬真菌亦可引起棉鈴曲霉病，但關于曲霉和附球菌對棉苗的影響未見相關報道，尚需對其作用進一步研究。

4 結 論

降水量為影響油后免膜直播模式下棉花苗期病害發生的最重要因子之一，病害發生主要在距播種后第1次降雨后1周左右的時間開始，且大降雨后1周為發病高峰期，做好苗期病害的防控工作。

分離到的病原菌中以鐮刀菌屬、鏈格孢屬和曲霉屬為主，其次為絲核菌屬和附球菌屬。