腫節風SCAR 分子標記克隆與驗證

羅 育 黃春喜 蔡丹昭 賀菽嘉 朱 丹

（1.廣西醫科大學基礎醫學院， 廣西 南寧530021； 2.廣西醫科大學第一附屬醫院藥學部， 廣西 南寧530021； 3.廣西醫科大學藥學院， 廣西 南寧530021）

腫節風為金粟蘭科草珊瑚屬植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai 的干燥全草，又名九節茶、草珊瑚、九接風等，2015 年版《中國藥典》 收載其作為法定藥材［1］。腫節風為常用中藥，其浸膏及以腫節風作為原料的中成藥如腫節風片、血康口服液、萬通炎康片也收載入2015 年版《中國藥典》［1］；腫節風注射液、新癀片、三蛇膽川貝膏及糖漿則收載入部頒藥品標準中［2］。腫節風作為我國傳統中藥材，對其相關研究主要集中在化學成分、藥理活性和臨床應用等方面［3?5］?，F代藥理研究表明［6?7］，腫節風具有抗菌、抗輻射、抗腫瘤、促進骨折愈合及鎮痛等多種藥理作用，尤其在治療腫瘤（胰腺癌、胃癌、直腸癌、肝癌、食道癌等）方面具有顯著效果［8?9］，且具有較好的安全性［10］。

由于腫節風需求量較大，市場上出現了雞爪蘭、金粟蘭、及己等與腫節風功效不盡相同的混淆品，已影響腫節風的醫療用途，降低了其藥用價值。目前，對中藥材鑒別的方法主要有理化鑒別、性狀鑒別和顯微鑒別［11?14］，若通過理化和性狀進行鑒別，其優點是方法較可靠，但缺點是比較費時耗力，而若采用顯微結構進行鑒別，其局限性較大，原因是該方法要求實驗人員有較高的鑒別能力，還要有合理的鑒別依據。相比而言，分子鑒別法鑒別中藥材，具有準確性高，其技術經培訓后實驗人員容易掌握，經驗性少，且省時省力的優點。

目前，應用分子鑒別法從基因水平對中藥材進行鑒定已有報道，常用的技術主要包括DNA 條形碼技術、DNA序列分析技術以及RAPD 技術等［15?19］。其中，DNA 條形碼技術是目前影響較大、應用較廣泛的DNA 鑒定技術，主要利用種間基因序列差異來進行物種鑒定［20］，但目前尚未有一致的植物DNA 條形碼標準片段，也甚少應用于對腫節風進行鑒定，因此需要篩選針對腫節風基因組的特異條形碼并標準化，最終是否適用于腫節風有待實驗驗證，這將是本課題組下一步考慮的研究。RAPD 技術是一種有助于研究新發現或改良物種遺傳多樣性的技術，也經常用于藥用植物或中草藥鑒定［21?25］，但準確性低，而如果通過RAPD技術獲得SCAR 分子標記，可以提高特異性和穩定性，雖然有時可能找不到特異的SCAR 分子標記，且需要大量的樣本數予以支持，但因所獲得的SCAR 分子標記可靠且易于使用，僅需PCR 和凝膠電泳便可以從電泳圖上直觀地反映鑒定結果，已被用于中草藥與其混淆品的區分，是鑒定中草藥的重要分子工具［26］。

本研究擬在分子水平上應用RAPD 技術及SCAR 分子鑒定標記對腫節風進行鑒別，以期找到能夠鑒別并區分其混淆品的特異引物，從理論上提供鑒定腫節風的新思路，并為鑒定腫節風及區分混淆品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 9 種腫節風和3 種同科混淆品雞爪蘭、及己與金粟蘭來自廣西藥用植物園、廣西融水、融安及福建三明等地區，由廣西中醫藥研究院賴茂祥研究員鑒定為正品，具體見表1，-20 ℃條件下貯藏于廣西醫科大學103 館2 樓綜合實驗室內。

表1 不同來源腫節風及其部分同科植物基因組DNA 純度與濃度

1.2 方法

1.2.1 腫節風基因組DNA 提取 采用課題組前期改良CTAB 法［27］提取腫節風基因組DNA。選取適量細嫩葉片，液氮中研碎并分裝至EP 管中。加入1.5×CTAB 及β?巰基乙醇，混勻后，65 ℃恒溫反應30 min，12 000 r／min 離心10 min。將上層溶液吸取至另一EP 管中，加等體積氯仿／異戊醇（24 ∶1），混勻后12 000 r／min 離心10 min，吸取至另一EP 管中，加1／10 體積1×CTAB 和等體積的氯仿／異戊醇（24 ∶1），混勻后同條件離心10 min，吸取至另一EP管中，加等體積1×CTAB，混勻后65 ℃恒溫反應30 min，同條件離心10 min，去除溶液留沉淀，加NaCl 溶解，同條件離心10 min。將溶液吸取至合適的離心管中，加2.5 倍體積無水乙醇，混勻后-20 ℃靜置15 min，同條件離心5 min，去除溶液留沉淀，70% 乙醇漂洗，同條件離心10 min，去除溶液，揮干管中殘液后加適量超純水，即得DNA 溶液，于-20 ℃下保存。

1.2.2 腫節風基因組DNA 質量檢測 取適量DNA 提取液，上樣于1% 瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液1×TAE，電壓100 V，電泳15 min，凝膠成像系統觀察并拍照。采用Quawell 3000 分析儀，直接讀取其A260／A280及濃度。

1.2.3 腫節風基因組DNA 進行RAPD 擴增［28］根據植物基因組DNA 特征，由Takara 公司提供的45 條隨機引物進行單一引物PCR 反應，反應體系包括10×緩沖液、Mg2＋、dNTPs、胎牛血清蛋白、單一引物、Templates、rTaqDNA 聚合酶、超純水，反應程序為94 ℃預變性；94 ℃變性，36 ℃退火，72 ℃延伸，進行35 個循環；最后補充延伸。產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照電泳結果。

1.2.4 腫節風SCAR 分子標記膠回收 用刀片將膠塊中的目的條帶切下，放置于已滅菌的1.5 mL 離心管中，稱定質量。按天根DNA 純化回收試劑盒說明書進行操作，回收產物通過瓊脂糖凝電泳進行檢測。

1.2.5 腫節風SCAR 分子標記的克隆、鑒定及測序 按照pEASY?T1 Cloning Kit（TransGen Biotech）的說明書進行連接反應，取3 μL 膠回收產物、1 μL 滅菌超純水、1 μLpEASY?T1，25 ℃保溫10 min。在上述連接產物中加入感受態細胞，冰上放置30 min，42 ℃水浴45 s，冰上放置2 min，加入細菌培養基，搖床中復蘇1 h，涂于平板上，37 ℃培養14～16 h，采用α?互補篩選攜帶重組質粒的細菌。

將重組菌落制成重組菌液，進行PCR 擴增，反應體系與程序同“1.2.3” 項。產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照電泳結果。

經α?互補篩選及PCR 鑒定后，取陽性重組菌液置于滅菌離心管中，做好標記并用封口膠密封，送往武漢金開瑞生物工程有限公司進行雙向測序。

1.2.6 腫節風鑒定特異性引物設計 利用Vector NTI 軟件對測序進行比對，確定4 種不同產地腫節風分子標記的同源序列，腫節風樣本分別是廣西藥用植物園3～4 年栽培品、福建三明5 年栽培品、廣西融水4 年栽培品，按照引物設計原則［29］，使用Primer Premier 5.0 軟件獲得評分高的引物，交由公司合成。

1.2.7 腫節風SCAR 分子標記特異性引物驗證 以表1 中9 種腫節風及雞爪蘭、及己與金粟蘭等3 種同科易混淆植物基因組DNA 為模板，使用自行設計引物進行PCR 反應，引物序列分別為S41?正向，5′?ATTTCCCATCCATCGTCG?3′；S41?反向，5′?CCTCCTCTTCCTGCTCCA?3′，反應體 系包括10×緩沖液、Mg2＋、dNTPs、引物、Templates、rTaq DNA 聚合酶、超純水，反應程序為94 ℃預變性；94 ℃變性，53.8 ℃退火，72 ℃延伸，進行30 個循環；最后補充延伸。產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照電泳結果。

2 結果

2.1 腫節風基因組DNA 提取與質量檢測 不同來源的腫節風基因組DNA 電泳結果見圖1。由此可知，9 種腫節風及3 種同科易混淆植物基因組DNA 條帶清晰明亮，表明提取獲得的基因組DNA 純度較高，而且所含雜質較少，DNA分子完整。核酸蛋白分析儀測定腫節風基因組DNA 的相關數據見表1，顯示所有樣品基因組DNA 的OD260／OD280值均在1.7～2.0 之間，質量濃度在100～550 ng／μL 之間，表明提取到的基因組DNA 純度較高，質量較好，可作為后續PCR 擴增的模板。

圖1 不同來源腫節風及部分同科植物基因組DNA電泳結果

2.2 腫節風基因組DNA 進行RAPD 擴增 從S41號隨機引物擴增的結果中獲得SCAR 片段，見圖2，顯示4 種不同產地的腫節風樣本RAPD 擴增后出現一致片段（1 000～2 000 bp），重復擴增均有相同的結果。因其片段大小適中，故可以篩選作為SCAR 分子標記。

圖2 4 種不同產地腫節風RAPD 擴增結果

2.3 菌液PCR 鑒定 α?互補篩選出陽性克隆菌落后，PCR擴增陽性克隆菌落進行鑒定，見圖3。由此可知，在1 000～2 000 bp 之間均出現了擴增條帶，且是唯一的條帶，大小與圖2 一致，清晰明亮，表明S41引物擴增獲得的SCAR 分子標記已成功插入pEASY?T載體中，克隆完成。

2.4 特異性引物鑒定 采用測序合并Vector NTI 軟件分析SCAR 分子鑒定標記的堿基序列，長度為1 352 bp（GenBank 登記號為MN244913），此序列作為模板設計出鑒別引物，擴增9 種不同產地腫節風及3 種同科混淆品雞爪蘭、及己與金粟蘭等基因組DNA，見圖4。由此可知，9 種腫節風均出現有唯一條帶（大小約為500 bp），并與預期擴增長度相符；3 種同科混淆品沒有擴增條帶，因為該引物是從腫節風基因組DNA 的堿基序列中獲得，也說明其屬于腫節風與同科植物的鑒別引物。同時，獲得了一種新的可進行腫節風鑒別的SCAR 分子標記。

圖3 菌液PCR 擴增結果

圖4 9 種不同產地腫節風及3 種同科混淆品特異引物擴增

3 討論

中草藥等藥用植物因其自身次生代謝物較復雜，提取基因組DNA 相對較為困難，若其中的次生代謝物不能有效去除，必將會影響到后續的PCR 擴增；本研究前期使用試劑盒提取腫節風基因組DNA，雖電泳檢測時能看到完整的DNA 條帶，但其A260／A280比值較差，均不在1.7～2.0 范圍，后續的PCR 擴增也得不到穩定的條帶。鑒于此，本研究選擇了CTAB 法并加以改良，最終獲得完整、高質量的腫節風及其他科植物基因組DNA，并能用于后續的PCR 擴增。

本研究在解決了基因組DNA 質量的基礎上，通過隨機引物獲得腫節風RAPD 標記，克隆并篩選轉化為SCAR 標記，與GenBank 上其他物種植物基因組DNA 序列進行比對，顯示同源性較低，表明其屬于腫節風基因組DNA 中的特有序列；以此SCAR 標記為模板設計鑒別引物，PCR 擴增結果顯示對9 種不同產地腫節風樣本的DNA 具有特異性，而在其他同科植物的DNA 中沒有PCR 擴增結果，表明篩選到了可用于腫節風鑒別的特異性SCAR 分子標記，因此結合RAPD 和SCAR2 種分子標記技術，以期建立一種可以對腫節風與其混淆品鑒別的方法，為藥用植物以及其他植物物種的遺傳特性與鑒別提供參考。