大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

徐輝 王麗霞 李生龍

摘要 為進一步確診臨床發病雞的病原，無菌條件下取肝臟，進行細菌的分離、培養及鑒定。鑒別培養基培養結果顯示，分離菌株在伊紅美藍培養基上出現帶有金屬光澤的菌落特征，在麥康凱培養基顯示出粉紅色菌落的特征。結果表明，7只患病雞均為大腸桿菌感染。然后，針對分離純化的菌株進行藥敏試驗。西藥藥敏試驗結果顯示，硫酸慶大霉素、阿米卡星、硫酸新霉素、安普霉素均為高敏，阿莫西林耐藥，而鹽酸多西環素和恩諾沙星為中敏。中藥藥敏試驗結果顯示，四黃止痢顆粒和楊樹花口服液對分離菌株比較敏感。該試驗結果可為大腸桿菌病的臨床用藥提供參考。

關鍵詞 病雞;大腸桿菌;分離與鑒定;藥敏試驗;藥物篩選

中圖分類號 S858.31 ?文獻標識碼 A ?文章編號 0517-6611（2020）19-0084-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.023

Abstract In order to further confirm the pathogen of diseased chicken in the clinic， the liver was collected under aseptic conditions to make the laboratory isolation，culture and identification of bacteria. The results of different culture media showed that the isolated strains showed the colony characteristic of metallic luster on EMB medium， ?and the MAC medium showed the characteristics of pink colony. The results showed that all seven infected chicken were infected with Escherichia coli. The drug sensitivity test results of western medicine showed that the gentamycin sulfate， amikacin， neomycin sulfate， and apramycin were highly sensitive to isolated strains， amoxicillin was tolerant to isolated strains， and doxycycline hydrochloride and enrofloxacin were intermediately sensitive to isolated strains. The sensitive test results of traditional Chinese medicine showed Sihuang Zhili Granules and Yangshuhua Oral Liquid were more sensitive to isolated strains. This experimental results could provide references for the clinical medication of colibacillosis.

Key words Sick chicken;Escherichia coli;Separation and identification;Drug sensitivity test;Drug screening

作者簡介 徐輝（1980—），男，安徽宿州人，獸醫師，從事畜牧獸醫技術推廣、動物檢疫和動物衛生監督執法工作。

收稿日期 2020-07-14

大腸桿菌是微生物界普遍存在的一種微生物，它主要寄生于人和動物腸道中，一般分為致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌，一般正常的禽類體內都會存在大腸桿菌潛在基因。大腸桿菌能引起禽類多種疾病，每年對養殖業和畜牧業都會造成巨大的經濟損失，隨著養殖場對抗生素的普遍應用，大腸桿菌不斷產生耐藥性，已經成為社會關注的熱點之一。大腸桿菌病的主要表現為精神頹廢、不能長時間站立、不食或厭食、頭部耷拉、呆立或蹲伏不動、肛門周圍羽毛沾有綠色或淺黃色稀糞。當雞體的免疫系統下降或者雞體的皮膚防御系統遭到破壞，就會傳染給其他雞群，導致大腸桿菌的大量繁殖，從而引發大腸桿菌類似疾病。病雞排出的細菌，也會經過空氣、糞便、飲水等方式傳染給健康雞群[1]。大腸桿菌這類疾病還是以預防為主，在養殖過程中應注意場地的衛生環境，同時加強養殖場的飼養管理和飲水衛生，除了對雞群進行科學的飼養管理、做好日常清潔、消毒等工作外，合理使用藥物也是防治該病的關鍵。

由于大腸桿菌對多種青霉素、磺胺類、氨基糖苷類都比較敏感[2]，所以社會廣泛使用敏感的抗生素對大腸桿菌來進行治療，這些年來由于抗生素的不正當使用，不僅造成耐藥菌株的不斷增加和抗生素的極大浪費，同時延長的治療時間也給養殖業和畜牧業帶來了嚴重的經濟負擔，所以在臨床上合理使用抗生素非常有必要，同時中藥制劑在臨床上的應用研究也不斷深入，如果篩選出有效的抗菌組方，就能減少抗生素給社會帶來的負面影響。

目前獸藥藥物的殘留問題也越來越受到人們的關注，已經成為社會熱點問題，尤其是肉雞與蛋雞的藥物殘留問題一直是國家有關部門嚴格監察的問題，鑒于目前養殖場對抗生素的廣泛使用，而蛋雞在產蛋期患病可用藥物較少，養殖戶迫于對疾病的治療和利益的追求，會選擇一些蛋雞禁用抗生素來進行治療，從而導致動物源性食品質量的不安全，還有患病動物長期服用抗生素可在體內殘留累積藥殘，人類食用含抗生素殘留的動物產品也會引起過敏反應，間接致病，嚴重時甚至能引起人類的生命安全。盡管抗生素在很大程度上能起到很好的治療效果，但長期使用抗生素會使雞大腸桿菌的耐藥菌種不斷出現和耐藥譜的不斷增加[3]，治療效果事倍功半，而中藥由于無耐藥性[4]，近年來在治療禽類大腸桿菌病癥中通過獸醫工作者的大量試驗已經取得顯著的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源。

在實習期與安徽華澳生物技術有限公司合作的數個養殖場送來數只疑似患有大腸桿菌疾病的病雞，其中包括安徽省肥西縣、六安市、亳州市、池州青陽縣、宿州市等。

1.1.2 臨床診斷。

對送檢病雞的精神狀況、采食飲水情況以及糞便情況進行觀察，主要表現為不食或厭食、精神萎靡不振、頭部耷拉呆立或蹲伏不動、肛門周圍羽毛沾有綠色或淺黃色稀糞，不能長時間站立。在無菌條件下對患雞進行解剖，觀察病變的器官組織。

1.1.3 試驗耗材與儀器。

試驗所用耗材有解剖剪、接種環、消毒棉簽、消毒鑷子、酒精燈、滅菌試管、培養皿、牛津杯、移液槍及槍頭等;試驗所用儀器有分析電子天平、百分電子天平、數控超聲波清洗器、高壓蒸汽滅菌鍋、電熱恒溫培養箱、電熱鼓風干燥箱、旋轉蒸發儀、水浴加熱鍋、水浴恒溫振蕩器、超凈工作臺等。

1.1.4 試劑。

生理鹽水、麥康凱瓊脂培養基（MAC）、伊紅美藍瓊脂培養基（EMB）、三糖鐵瓊脂（TSI）、大腸桿菌生化鑒定管、營養瓊脂培養基、營養肉湯培養基、革蘭氏染液等。

1.1.5 病原菌獲取。

在實習期間安徽華澳生物技術有限公司各地區技術員從其負責區域養殖場送來數只疑似患有大腸桿菌病的病雞，經剖檢觀察病雞初步診斷是否患有大腸桿菌癥狀，在無菌環境下取其病變的器官（如肝臟、心臟或分泌物），并將對應的病雞做好標記，然后將采集的病料及時放于冰箱中冷藏備用。

1.1.6 藥品配制。

參照CLSI標準、獸藥國家標準和中華人民共和國獸藥典（2015年版）一部確定各種抗生素母液所用藥物原料的有效含量（或單位效價）及溶劑稀釋劑方法[5]。該試驗所制母液的理想濃度為1 024 μg/mL，根據理論母液濃度計算出配制100 mL母液所需的原藥質量，具體配制方法見表1[6]，計算公式如下：

母液理想濃度=藥物原料質量×效價1 024 μg/mL=100 mL

鴨漿寧：稱取50 g樣品，加入10倍量的水，水浴蒸煮1 h，在同樣條件下提取3次，將3次所得提取液進行統一抽濾，然后將其旋轉蒸發濃縮至50 mL待用。

大桿康：稱取30 g樣品加入100 mL水，攪拌溶解待用。

楊樹花口服液：取安徽華澳生物技術有限公司生產的楊樹花口服液，搖勻待用。

四黃止痢顆粒：稱取100 g樣品，加入100 mL水，攪拌溶解待用。

在微生物室無菌環境下將配制好的藥液分別用無菌注射器吸取后，再裝入0.22 μm無菌濾頭進行過濾，然后將過濾好的藥液分裝到經高壓滅菌的離心管中，按壓封緊，用記號筆標記好相應藥物，置于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與培養。

將病料從冰箱取出，用滅菌后的解剖剪刀剪去病料表面被污染的部分，再用消毒過的棉簽沾取病變器官內的組織液，分別在麥康凱瓊脂培養基和伊紅美藍瓊脂培養基上面進行涂抹，形成十字區域，接種完成后于恒溫箱37 ℃培養18～24 h，觀察菌落生長形態。

1.2.2 病原菌的鏡檢。

采用革蘭氏染色法對病原菌進行染色鏡檢，革蘭氏染色具體步驟如下。

1.2.2.1 初染。點燃酒精燈，將載玻片用洗瓶先沖洗干凈，用吸水紙擦干或自然晾干，再用接種環從伊紅美藍培養基或者麥康凱瓊脂培養基挑取單個菌落涂抹于載玻片中心區域，涂抹成薄薄的一層，然后滴加草酸銨結晶紫染液到涂菌部位，染色2 min后，用洗瓶沖洗數次。

1.2.2.2 媒染。加碘液，保存1 min，再傾斜載玻片傾去碘液，最后用洗瓶沖洗至無色。

1.2.2.3 脫色。用吸水紙將載玻片上的水吸干或者自然晾干，然后再用95%乙醇脫色，持續30 s后立即洗去95%乙醇。

1.2.2.4

復染。將載玻片上的水自然晾干或用吸水紙吸干，再用番紅復染色2 min，水洗，最后用吸水紙吸干。

1.2.2.5

結果觀察。將載玻片涂上香柏油，置于顯微鏡下由低倍切換到高倍鏡觀察。

1.2.3 病原菌的生化鑒定。

選取從麥康凱瓊脂培養基上長出的粉紅色菌落或者伊紅美藍瓊脂培養基上長出的黑色帶有金屬光澤的菌落接種到三糖鐵培養基中恒溫37 ℃培養18～20 h，檢查該菌株對糖的發酵能力、是否產酸產氣，如果有相應現象產生，則表明該菌種是大腸桿菌。

1.2.4 大腸桿菌的藥敏試驗。

1.2.4.1 菌液的制備。

用接種環分別挑取EMB培養基上的單個紫黑色菌落接種到營養肉湯培養中，在水浴振蕩培養箱中37 ℃恒溫培養8 h左右，然后用紫外可見分光光度計在波長600 nm處測定菌液OD值，最好用營養肉湯進行校零。

①吸取0.5 mL菌液加入到9.5 mL營養肉湯中，混勻后檢測OD600 nm是否介于0.08～0.10。

②根據測定數值結果，調整原培養液濃度（用營養肉湯稀釋原培養液以降低OD600 nm值或者延長原培養液的培養時間來升高OD600 nm值）。

③用于點板的菌液需在上述步驟稀釋所得的混合液基礎上再稀釋1 000倍或直接使用原培養液稀釋10 000倍。

1.2.4.2 藥物 MIC的測定。

①無菌96孔板第1行加入200 μL營養肉湯，第2行加入100 μL營養肉湯+100 μL制備的菌液，第3～8行加入100 μL營養肉湯。

②第3～8行每行第一孔加入一種抗生素母液100 μL，逐次倍比稀釋至第12孔，最后從每行第12孔棄掉100 μL。

③第3～8行每孔加入100 μL制備菌液。

④制備菌液和抗生素上樣完畢后蓋好板蓋，37 ℃恒溫孵育12～20 h后觀察結果。

結果判讀：當第1行所有孔無細菌生長、第2行所有孔有細菌生長時，第3～8行每行最后一清亮孔所對應的藥物濃度為該藥的MIC。當出現跳孔現象，若為單一跳孔，記錄最高MIC，若為多處跳孔，則此行無效，不報告該種藥物的MIC。當第1行有孔出現細菌生長現象，同樣不應該報告該板所檢測的各抗菌藥物的MIC。

1.2.4.3 牛津杯法檢測。

在超凈工作臺中，打開送風，點燃酒精燈，將普通瓊脂培養基倒入7個培養皿中并鋪平，待其完全凝固即可，然后，用消毒過的棉簽沾取每株病原菌于培養皿中輕輕涂抹，呈十字區域;然后，用記號筆在培養皿底部分成5塊區域，每塊區域分別標注為鴨漿寧、大桿康、楊樹花口服液、四黃止痢顆粒、新霉素（西藥對照）;用消毒過的鑷子往每塊培養皿上放上5個滅菌的牛津杯，輕輕按壓，使其與培養皿表面貼合無空隙[7]，分別加入各試驗用藥200 μL，完成后將其置于37 ℃培養箱中培養10～12 h后再觀察結果。

1.2.4.4 藥物敏感試驗判定標準。

中藥細菌抑菌圈直徑標準判定如下：若抑菌圈直徑>20 mm，判為極敏;若抑菌圈直徑為15～20 mm，判為高敏;若抑菌圈直徑為10～14 mm，判為中敏;若抑菌圈直徑為0～10 mm，判為低敏;若抑菌圈直徑為0，判為不敏。

2 結果與分析

2.1 臨床診斷結果

對送檢病雞的精神狀況、采食飲水情況及糞便情況進行觀察，可見病雞個別頭部耷拉、精神萎靡、呆立不動（圖1A）;病雞解剖結果見圖1B、C。

2.2 病原菌鑒定結果

經選擇性培養基分離培養后，結果發現此病菌接種在普通瓊脂培養基上培養18～24 h，形成圓形、濕潤、半透明、隆起的乳白色中等大小菌落;在伊紅美藍培養基上長出黑色稍凸圓形菌落，直徑大小約2～5 mm，菌落邊緣整齊且表面光滑濕潤，并帶有金屬光澤（圖2A）[8];在麥康凱培養基上長出邊緣整齊且表面光滑濕潤的粉紅色菌落，直徑2～5 mm圓形凸起（圖2B）[9];然后，再挑取典型的大腸桿菌單株菌落在營養肉湯培養基上傳代培養2～3代，使細菌生長穩定，狀態良好。最后，經過肉湯培養的病原菌標號分別為C-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6、C-7。

2.3 病原菌的鏡檢結果

經鏡檢，病原菌革蘭氏染色結果為陰性桿菌，如圖3所示。

2.4 病原菌的生化鑒定結果

通過對病原菌進行三糖鐵生化鑒定，結果顯示為斜面和底層產酸，不產硫化氫，靛基質試驗和甲基紅試驗結果均呈陽性，VP試驗和西蒙氏檸檬酸鹽試驗結果均呈陰性，符合大腸桿菌生化特性，表明該病原菌為典型的大腸埃希氏菌。

2.5 微量肉湯稀釋法檢測MIC結果

用滅菌96孔板測定

試驗分離純化出的7株大腸桿菌，各孔板陰性對照均未見細菌生長，陽性對照的細菌在孔內生長情況良好，各抗菌藥對大腸桿菌的MIC（最低抑菌濃度）見表2。

由表2可知，96孔板試驗結果顯示硫酸慶大霉素、阿米卡星、硫酸新霉素和安普霉素對分離的7株大腸桿菌的MIC值較其他藥物更低。

2.6 牛津杯法檢測結果

通過牛津杯法檢測試驗所選中藥對7株大腸桿菌的藥敏性[10]，結果見表3、4。

由表3可知，該試驗所用中藥對分離的大腸桿菌菌株都有不同程度的敏感性，其中四黃止痢顆粒、楊樹花口服液對每株菌種均具有極高的敏感性，與新霉素的敏感度一致;鴨漿寧和大桿康只對某些菌株有很高的敏感性。

從大腸桿菌藥物敏感試驗結果（表4）可知，四黃止痢顆粒和楊樹花口服液與對照硫酸新霉素的敏感度相同，均為100%;鴨漿寧和大桿康敏感度低于楊樹花口服液、四黃止痢顆粒和硫酸新霉素，分別為85.7%和71.4%，由此可見中藥組方優先選用楊樹花口服液和四黃止痢顆粒。

3 討論

3.1 臨床耐藥菌產生的原因

大腸桿菌是一種無芽孢的革蘭氏陰性菌，常見的腸道感染菌種之一，在正常的雞體內也會存在潛在大腸桿菌，當雞體的皮膚防御系統遭到破壞和免疫系統降低時，雞群便會遭到感染，再傳染給其他雞群，從而誘發大腸桿菌類疾病。為了能快速控制雞群疾病，養殖場會優先使用新一代抗生素或大劑量、大組方進行治療，長期以往容易導致細菌產生耐藥性。近些年，大腸桿菌的耐藥率和耐藥譜不斷增高，而且目前被發現的大腸桿菌的血清型有很多種[11]，很大程度上增加了獸醫工作者的工作難度，還間接導致食品安全問題的越來越嚴重，尤其是蛋雞和肉雞攜帶的耐藥基因會通過食物鏈等方式傳給人類[12]，危害食品安全和人類健康。該試驗結果顯示各種抗菌藥物對不同地區的大腸桿菌病原菌的敏感度不一樣，產生的原因應該是與各地區的用藥史有關，由于檢測的病雞來源于不同地區，所以導致不同地區的大腸桿菌對各種藥物的敏感度不一樣[13]。通過藥敏試驗可選擇發病場的敏感藥物對患有大腸桿菌病的雞群進行治療，能達到較好的治療效果，也能避免細菌耐藥性的產生。

3.2 減少藥物殘留的方法

隨著抗生素的廣泛使用，藥物的殘留導致動物源性的食品安全問題越來越嚴重，尤其體現在蛋雞和肉雞上，它們體內攜帶的耐藥基因和藥物殘留會通過食物鏈等方式傳給人類，嚴重危害食品安全和人類健康[14]。中藥組方或單方治療模式便應運而生，因為中藥在目前沒有被發現很強的耐藥性，相比于抗生素中耐藥性其危害可以忽略不計，因為中藥組方主要調節機制就是改善機體內的新陳代謝，使之調節到平衡穩態，缺點就是沒有抗生素效果來的有效和快速。因此，在減少藥物殘留方面，在速成的肉雞前期發病可選用療效快速的西藥組方，同時也要注意用藥劑量和療程，合理用藥。等病情穩定后再改用中藥組方進行療效鞏固，應分開該場保健和常用治療藥物。此外，蛋雞在生長期可選用西藥組方，開產后發病的可選用無抗組方，在最大程度上減少藥物的殘留問題。

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