結核分枝桿菌對德拉馬尼的耐藥機制研究進展

劉原園 初平 韓書婧 楊慧 魯潔

結核病是全球重大的公共衛生問題，日益增加的耐多藥和廣泛耐藥結核病(MDR-TB/XDR-TB)是結核病廣泛傳播的重要原因之一[1-2]。與對藥品敏感的結核病相比，MDR-TB的治療需要4～6種抗結核藥品聯合使用，其中也包括毒性更強但效力較弱的二線藥品，可使其治療時間長達2年，具有治愈率低、治療時間長、死亡率高等特點[3-4]，同時XDR-TB的治療成功率也僅為44%[5]。近年來，抗結核藥品的研發取得了一些新的進展。其中，德拉馬尼(delamanid，Dlm)首次獲得歐洲藥品管理局的批準，被世界衛生組織列入MDR-TB治療指南，可與標準抗結核方案聯合用于成年MDR-TB患者[6-7]，為治療MDR-TB/XDR-TB帶來了希望。然而，Dlm作為新藥，其耐藥株的及時檢測對于最大限度地減少耐藥風險及保持藥品的有效性也是至關重要的。筆者對Dlm的耐藥機制及其耐藥相關基因突變進行綜述，為Dlm耐藥株的早期分子檢測提供參考。

一、 Dlm的作用機制及抗菌活性

Dlm又稱為OPC-67683，是一種硝基二氫咪唑類衍生物，由日本大冢制藥有限公司研發。其作用機制主要是抑制分枝菌酸的生物合成，尤其是甲氧基分枝菌酸和酮類分枝菌酸[8]，進而擾亂細胞壁的合成，促進藥品對分枝桿菌的滲透[9]。此外，一項轉錄組測序(RNA-seq)技術的研究顯示，Dlm可限制MTB的有氧呼吸，提示呼吸中毒在其殺菌作用中也起著至關重要的作用[10]。

研究表明，無論臨床MTB分離株對一線抗結核藥品是否耐藥，Dlm對其在體外和體內均顯示出較低的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC；范圍為0.006～0.024 mg/L)，具有很強的抗結核活性[8, 11]，可認為Dlm對細胞內復制活躍、低氧條件下非復制的MTB均具有較強的殺菌能力，且與目前使用的任何抗結核藥品均不存在交叉耐藥性[7,10]及相互作用。另有研究提出，Dlm也與抗逆轉錄病毒藥品無相互作用[12]，且MDR-TB患者對其耐受較好，最常見的不良反應是胃腸道反應和失眠，提示Dlm對于并發HIV感染/AIDS和MDR-TB患者具有較好的抗菌活性。然而，Dlm用于臨床僅1年，西藏就出現了首例對Dlm耐藥的結核病患者，同時也對另一種抗結核新藥貝達喹啉耐藥[13-14]。因此，為有效預防Dlm耐藥的發生，應當深入研究其耐藥機制。

二、 Dlm的耐藥機制

1.Dlm的自發耐藥率：MTB對Dlm的耐藥性可由自發的基因突變引起。已報道的研究中，MTB標準株(H37Rv)對Dlm的自發耐藥頻率為6.44×10-6～4.19×10-5，卡介苗東京株為2.51×10-5～3.95×10-5，與異煙肼相似[8, 15]。另外，Kardan-Yamchi等[16]納入了35株利福平耐藥MTB菌株，發現9株(25.7%)對Dlm呈表型耐藥；而Wen等[17]檢測了MDR-MTB和XDR-MTB各110株菌株，發現僅有4株(3.6%)和3株(2.7%)對Dlm耐藥；Yang等[18]納入了420株臨床MTB分離株，發現41株(9.8%)對Dlm耐藥，其中15株為MDR-MTB、11株為XDR-MTB、9株為前廣泛耐藥(pre-extensively drug resistant，pre-XDR)菌株；Pang等[19]研究檢測了90株XDR-MTB臨床分離株，發現對Dlm的耐藥率為4.4%；Schena等[20]分析了未采用Dlm治療的結核病患者的159株臨床MTB分離株，體外耐藥性檢測發現僅4株對Dlm耐藥。這些研究表明，不同來源的臨床分離菌株對于Dlm的耐藥率不盡相同，進一步說明對臨床分離菌株及時進行Dlm耐藥性檢測的必要性。

2.Dlm的耐藥機制：有研究認為，MTB獲得性耐藥與其藥物靶點基因或參與藥物激活基因的突變密切相關[21]。Dlm作為一種前體藥品，需要脫氮黃素依賴性硝基還原酶[deazaflavin (F420cofactor)-dependent nitroreductase，Ddn]激活其抗結核活性[15](圖1)。而Ddn的酶活性依賴于脫氮黃素F420輔因子的氧化還原循環，該循環將還原形式的F420(F420H2)氧化成F420，再由F420依賴性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase，Fgd1)將F420還原[7]，為下一個循環周期的使用做準備。F420輔因子由3種F420生物合成蛋白(F420biosynthesis protein，Fbi)——FbiA、FbiB和FbiC共同參與合成。

在實驗室誘導耐藥研究中發現，Dlm激活途徑中的5個基因[ddn(編碼Ddn酶)、fgd1(編碼Fgd1)、fbiA、fbiB和fbiC(分別編碼FbiA、FbiB和FbiC)]中的任一基因突變都可能導致對Dlm的耐藥性[15]。根據耐藥相關基因的不同，將Dlm耐藥機制分為3類：一是ddn基因突變，導致Ddn蛋白結構異常、功能喪失，破壞了依賴于F420的硝基還原酶途徑；二是fbiA、fbiB和fbiC基因突變，導致F420合成酶的功能異常，產生非功能性形式的F420；三是fgd1基因突變，導致氧化形式F420的積累，也與Dlm耐藥性有關[15, 22]。此外，Ddn能將Dlm轉化為無活性的去硝基形式代謝物[8]，而Dlm殺滅MTB的確切靶點尚未可知，因此推測在此硝化還原過程中產生的尚未鑒定的活性中間體是Dlm發揮療效的原因[7]。

圖1 參與德拉馬尼生物激活的基因

三、 Dlm耐藥基因的相關突變

據報道，Ddn、Fgd1和FbiA對MTB在體外的最佳生長不是必需的，也沒有需要FbiB和FbiC必要性的證據[23]。筆者綜合了現有涉及Dlm耐藥基因突變結果的11篇文獻，對已報道的96株Dlm耐藥突變株的基因突變位點進行綜述分析，發現ddn基因突變最常見(50株)，其次是fgd1(21株)、fbiA(11株)、fbiC(11株)基因，而fbiB基因突變最少，僅3株。

(一)ddn基因突變

已報道的對Dlm發生ddn基因突變的MTB共計62株，其中50株為耐藥菌株，12株為敏感菌株。共發現9個非同義突變、1個同義突變、6個移碼突變(插入/缺失突變)(表1)。

Trp88STOP**突變是攜帶有提前終止密碼子的ddn突變，與耐藥相關，且可使MTB分離株的MIC值增加1000倍(>32 mg/L)[20]，可能與其突變導致Ddn酶蛋白合成失敗或結構異常，使其硝基還原功能喪失，從而對Dlm耐藥有關[24]；另外，突變頻率最多的是81位密碼子，其中Gly81Ser突變分別在耐藥株和敏感株中被發現，故不能確定Gly81Ser突變是否與耐藥有關[18]；而Gly81Asp、Gly53Asp、Asn91Thr、Leu107Pro突變分別在2、3、2、1株耐藥株中被發現，提示與耐藥相關，認為可能與Gly53Asp和氨基酸G53位于Ddn蛋白的保守結構域，可替換其影響酶的功能有關[25]。而6個移碼突變菌株也均與耐藥相關，且MIC值除91G 缺失外均處于相對高的水平。

(二)fgd1基因突變

已報道的對Dlm發生fgd1突變的MTB共有109株，其中21株為耐藥菌株、88株為敏感菌株。共發現有4個非同義突變，2個同義突變，3個移碼突變(表2)。

耐藥菌株中，Ghodousi等[26]發現1例應用Dlm后出現耐藥的患者，對其臨床分離株進行測序后顯示為Gly104Ser突變，由此推測Gly104Ser突變可能與Dlm耐藥相關。而Ala89Pro突變、227C位點缺失、630G位點插入突變，均僅在耐藥株中被發現，提示與Dlm耐藥相關性較高(MIC>25 mg/L)[15]。Bloemberg等[13]發現1株G49移碼突變與出現對Dlm的表型耐藥相吻合，也可認為與Dlm耐藥有關。但突變頻率最高的Phe320Phe同義突變，分別在10株耐藥株[15, 17]和72株敏感株[20]中被發現，提示與耐藥性無關。同時，Lys296Glu和Lys270Met兩個非同義突變和Tyr155Tyr同義突變分別在敏感株中被發現[20]，暫可認為均與Dlm耐藥無關。

(三)fbiA基因突變

已報道對Dlm發生fbiA基因突變的MTB共計41株，其中11株為耐藥株、30株為敏感株，共發現11個非同義突變、7個同義突變、3個移碼突變(表3)。

耐藥菌株中，提前終止密碼子突變Lys250STOP**與1株 Asp106Gly突變具有較高的MIC值，推測是導致Dlm耐藥的突變。Bloemberg等[13]研究發現3株第49位密碼子的Asp49Thr突變，且突變頻率增加，與對Dlm表型耐藥的出現時間相吻合；另一研究也發現第49位密碼子上不同的Asp49Tyr突變[14]，提示第49位密碼子突變可能與耐Dlm有關。Wen等[17]研究發現1株Glu249Lys非同義突變，推測可能與MTB對Dlm的高水平耐藥有關。另外，272—275CAGG插入，以及452A、222C、223C缺失僅出現在耐藥菌株中(MIC>25 mg/L)[15]，提示插入與缺失突變對Dlm耐藥有直接影響。而發生Arg175His突變的10株菌株中，僅1株為耐藥株[13-14]，提示Arg175His與Dlm耐藥相關性較小。

表1 Dlm耐藥相關ddn基因突變

表2 Dlm耐藥相關fgd1基因突變

表3 Dlm耐藥相關fbiA基因突變

同時，突變的敏感株包括Gln120Arg、Thr302Met、Ala37Asp、His295Tyr、Ile220Ser等非同義突變，以及249、144、113、63、181、194、267等密碼子位點同義突變，可見fbiA基因突變位點較多，但多數突變與Dlm敏感相關。

(四)fbiB基因突變

已報道對Dlm發生fbiB基因突變的MTB共計13株，其中2株為耐藥株、11株為敏感株；發現3個非同義突變、1個同義突變、2個移碼突變(表4)，其中1148C—1155G與1263G—1264G缺失突變僅在耐藥株中發現[15]，可認為與Dlm耐藥直接相關。而敏感株中發現的1株Thr92Thr同義突變[25]和3株非同義突變(Leu447Arg、Lys448Arg、Phe220Leu)[20]，認為均與Dlm耐藥無關。

(五)fbiC基因突變

已報道對Dlm發生fbiC基因突變的MTB共計23株，其中11株為耐藥株、12株為敏感株；發現7個為非同義突變、4個同義突變、4個缺失突變(表5)。

在耐藥菌株中，1339G、811G、813C、699C和1638T等不同位點的缺失突變均具有很高的MIC值[15]，可認為與Dlm耐藥直接相關。提前終止密碼子Arg220STOP**突變的MIC>25 mg/L[15]，推測與Dlm耐藥相關。Pang等[19]研究認為，2株Val318Ile突變是潛在的與Dlm耐藥相關的非同義突變；而Cys98Tyr和Leu53Pro非同義突變的MIC值也同樣很高[15]，認為三者均為Dlm耐藥的相關突變。Rancoita等[24]發現2株Arg536Leu突變，且在同一實驗中發現ddn基因的Trp88STOP**突變比fbiC基因的Arg536Leu突變的耐藥相關性更高，說明ddn基因對Dlm耐藥性的產生更為關鍵。

表4 Dlm耐藥相關fbiB基因突變

表5 Dlm耐藥相關fbiC基因突變

Thr273Ala及Thr681Ile非同義突變和4個不同位點(密碼子位點分別為55、182、67、811)的同義突變[21]僅在敏感株中出現，暫認為與Dlm耐藥無關。

四、Dlm與普托馬尼交叉耐藥突變

普托馬尼(pretomanid)，又名PA-824，與Dlm同為硝基咪唑類抗結核藥品，有著相同的耐藥機制和耐藥相關基因[27-28]。目前，僅Wen等[17]報道了1株對Dlm及PA-824同時耐藥的菌株，且均有較高的MIC值(MIC>16 mg/L)，其fbiA基因存在Glu249Lys突變，提示Glu249Lys為硝基咪唑類抗結核藥品的共同耐藥相關突變。

五、展望

對Dlm耐藥的ddn、fgd1、fbiA、fbiB、fbiC5個基因突變均存在同義、非同義突變及移碼(插入/缺失)突變，且除Phe320Phe外所有同義突變均為非耐藥相關突變，所有移碼突變均與耐藥相關；而對于僅在耐藥株中出現的非同義突變，可以推測與耐藥相關。建議進一步對與耐藥相關的單氨基酸改變頻次較高的ddn、fbiA、fbiC基因進行生物信息學分析，可能有助于闡明突變的耐藥途徑及確定有效突變位點。雖然與fgd1相關耐藥突變位點的報道不多，但因有臨床病例證據，認為也有必要進一步實驗研究。而對于在各項研究中報道最少的fbiB突變，因未發現與耐藥相關的單氨基酸改變，筆者認為研究價值相對較低。

綜上所述，筆者對Dlm耐藥基因的突變進行了詳細分析，為進一步研究Dlm耐藥性機制和開發新的快速的分子藥物敏感性檢測方法提供了理論參考，對指導臨床早期進行分子診斷具有重要意義。