一株孔雀石綠降解菌Citrobacter sp.D3的分離鑒定及降解特性

劉菁華 孫振中 陳琳

摘要：[目的]篩選獲得可高效降解孔雀石綠的菌株。[方法]采用富集馴化的方法對漁業養殖環境中的著微生物進行分離篩選，獲得的降解菌株通過生理生化、掃描電鏡和16SrDNA分析進行鑒定，采用單因素試驗研究溫度、pH及藥物初始濃度對菌株降解效率的影響，并對其降解動力學參數進行分析。通過發光細菌法結合高分辨質譜儀對其降解產物的綜合毒性和降解途徑進行分析。[結果]從上海某漁業養殖池塘中分離到一株孔雀石綠降解菌D3，初步鑒定其為檸檬酸桿菌Citrobacter sp.。菌株D3在pH7～8、溫度30～35C的環境中具有較好的生長和降解率，在該條件下，菌株對質量濃度為2mg：L～的孔雀石綠的降解率為96.32%，半衰期為0.5630d，且其代謝產物隱性孔雀石綠無明顯累積;孔雀石綠質量濃度超過30mg：L^，菌株生長及降解受到明顯抑制。菌體降解孔雀石綠可以用一級反應動力學方程描述，擬合曲線的相關系數在0.9169～0.9635。菌株對孔雀石綠的降解產物綜合毒性降低明顯，72h降解產物對發光細菌的抑制率降低50%以上。從降解產物中解析獲得3種特征降解中間產物，分別為4-二甲氨基二苯基甲酮（m/z=226.12）、N，N-二甲基苯胺（m/z=122.10）和4-二甲氨基一苯酚（m/z=138.09），推測D3菌株對孔雀石綠的降解過程為逐步脫掉苯環獲得次級代謝產物。[結論]D3菌株對孔雀石綠具有很好的降解效果，對解決漁業生態中的孔雀石綠殘留具有較高的應用價值。

關鍵詞：顯性孔雀石綠;隱性孔雀石綠;微生物降解

中圖分類號：X172

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）060657-08

0引言

[研究意義]孔雀石綠（Malachitegreen，MG）作為工業用染色劑和細胞化學染色劑等被廣泛應用。1933年，研究發現孔雀石綠具有抗菌的藥效，之后許多國家開始將孔雀石綠廣泛用作殺菌劑，主要用于殺滅養殖水體環境中的寄生蟲、原生動物和魚卵中的霉菌等?？兹甘G會在水生動物體內代謝成無色孔雀石綠（Leucomalachitegreen，LMG），孔雀石綠和無色孔雀石綠在水生動物體內長時間殘留，可產生高度致畸、致癌和突變效應則?？紤]到孔雀石綠的毒性，各國紛紛將其列入水產養殖的禁用藥物名單，然而，由于孔雀石綠價格低廉、抗菌效果顯著，而且還沒有研制生產出更好的替代藥物，因此直到現在，仍不斷有違規使用孔雀石綠的情況發生。在水產品抽樣檢查中發現孔雀石綠仍然存在殘留超標現象，在漁業生態環境監測中，孔雀石綠在養殖底泥中殘留現象較為突出，如何安全有效地去除漁業環境中的孔雀石綠藥物殘留已成為水產養殖領域待解決的問題。[前人研究進展]目前，國內外研究孔雀石綠藥物降解的方式主要有光降解引、化學降解和生物降解。相對于物理化學方法費用高、副作用大等不足，生物修復方法具有高效、成本低、無二次污染等優勢。然而，目前利用微生物降解藥物研究主要集中在堆肥、城市污水、湖泊和土壤等環境領域。吳永利等從印染廠污泥中分離到一株假單孢菌Pseudomonassp.，該菌株處理化工廢水中高濃度孔雀石綠效果理想。熊晶晶等叫從鹽場的鹽田中分離了一株耐受高鹽環境的菌株，菌株對150gLT的NaCl濃度具有較高的適應性，適用于高鹽度條件下孔雀石綠的降解。而對于漁業養殖環境中孔雀石綠殘留的積累模式、降解行為和生物修復技術研究較少，有報道利用高錳酸鉀去除養殖水體中孔雀石綠效果較好，在非養殖期間通過翻耘、暴曬和潑灑生石灰等方法也可降低養殖底泥中孔雀石綠殘留叫。[本研究切入點]但整體而言，對于漁業養殖環境中孔雀石綠殘留的積累模式、降解行為和生物修復技術研究較少，特別是與生物降解相關菌株的篩選。開展養殖環境中孔雀石綠及其代謝產物隱性孔雀石綠的微生物降解行為及生物修復技術研究，不僅對明確生物修復過程中藥物的降解途徑和機理具有重要的作用，而且對養殖環境的保護水產品質量安全等具有重要意義。[擬解決的關鍵問題]本研究從漁業養殖池塘中分離獲得一株可高效降解孔雀石綠的菌株，且其降解過程中代謝產物隱性孔雀石綠無明顯累積，采用生理生化、掃描電鏡及16SrDNA對菌株進行生理生化、菌體形態特征及分子生物學鑒定，同時對其降解特性進行初步研究，并結合生物毒性測試儀及高分辨質譜儀對菌株的降解產物及降解途徑進行分析探討，以期為該菌株在漁業養殖環境中降解孔雀石綠的應用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

島津LC-20AD液相色譜儀、ABsCIEXQTRAP@6500質譜聯用儀、LTQOrbitrapXL（ThermoFisherScientific）、渦旋振蕩器（IKAMS3）、超純水機（美國Millipore公司）、Centrifuge5810R型離心機（德國Eppendorf公司）、恒溫培養搖床（上海一恒THZ-100）、濱松光子水質安全毒性測試儀（HP514）。

乙腈和二氯甲烷為色譜純（TEDIA）;PRS固相萃取柱（AgilentBondElut）;乙酸和乙酸銨等化學純試劑購自國藥集團化學試劑有限公司。

孔雀石綠標準品：顯性孔雀石綠（Malachitegreen，MG）、隱性孔雀石綠（Leucomalachitegreen，LMG）購自德國Dr.Ehrenstorfer。氘代顯性孔雀石綠（Malachitegreen-D5，MG-D5）、氘代隱性孔雀石綠（Leucomalachitegreen-D6，LMG-D6）購自德國WITEGA。

乙酸銨溶液（0.125molI"）：9.635g乙酸銨溶于1LHO，乙酸調pH=4。

0.2%乙酸銨溶液、標準儲備液（500pg：mL'，和內標標準儲備液（200ug：mLl）。

基礎培養基：磷酸二氫鉀3.0g，七水硫酸鎂0.1g，硝酸銨2.0g，無水CaCl，0.01g，磷酸氫二鉀1.5g，乙二胺四乙酸二鈉0.01g，過濾養殖水體1000mL，pH7.6～7.8，高壓蒸汽滅菌（121C，15min）后制得。

營養培養基：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化鈉5.0g，葡萄糖1.0g，過濾養殖水體1000mL，pH7.6～7.8，高壓蒸汽滅菌（121C，15min）后制得。

富集培養液：在營養培養基中加人孔雀石綠藥物，使孔雀石綠藥物質量濃度為5mgL。

孔雀石綠降解液體培養基：99%基礎培養基，1%營養培養基，添加孔雀石綠質量濃度為5mgL。

孔雀石綠瓊脂平板：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，121C高壓滅菌15min，冷卻，添加孔雀石綠溶液，混勻倒平板。

1.2孔雀石綠降解菌的分離、篩選上海市郊區某養殖魚塘采集底泥樣品，取適量底泥于無菌狀態下，加入含孔雀石綠5mgL”的富集培養液的250mL三角瓶中，在溫度30C、轉速160r*min的條件下，馴化培養3d，待培養液渾濁且顏色變淺后，按10%的接種量轉接至下一批次新鮮富集培養液中，并逐步加大孔雀石綠投加濃度，如此重復，投加梯度質量濃度為5、10、15、20、25mgL。取最后一次獲得的培養液，稀釋5～8倍后，取100uL涂布于孔雀石綠瓊脂平板上，30C恒溫培養24h，挑選單菌落，連續平板劃線3次以上，獲得純化單菌落，將純化后的各菌落接至孔雀石綠降解液體培養基中振蕩培養24h（30C，160rmin），通過高效液相色譜串聯質譜儀（HPLC-MSMS）檢測降解液體培養液中孔雀石綠殘留量，同時檢測其代謝產物隱性孔雀石綠累積情況，最后篩選獲得對孔雀石綠具有高效降解能力且降解過程中隱性孔雀石綠無明顯累積的菌株，降解菌使用20%甘油凍干管于-80C冰箱冷凍保存。

1.3菌種鑒定

根據細菌分類鑒定標準，從菌株個體形態特征、菌落特征等方面進行初步鑒定。利用常規方法進行革蘭氏染色觀察，根據細菌鑒定手冊對菌株進行生理生化試驗，通過掃描電子顯微鏡觀察菌株D3的細胞形態，利用分子生物學手段進行菌株鑒定，提取D3基因組DNA作為模板進行16SrRNA基因的擴增，測序獲得完整的16SrRNA基因序列，將菌株D3的16SrRNA基因序列在NCBI上進行同源性比對分析。

1.4HPLC-MS/MS檢測孔雀石綠方法

培養液8000r離心3min，取100uL溶液，稀釋到10mL水體中，加入300yL質量濃度為0.24gmL'的氘代孔雀石綠和氘代隱性孔雀石綠混合內標，取1mL樣品過PRS固相萃取柱，PRS柱子經過活化（2mL乙腈、2mL水），上樣，淋洗（2mL水、2mL乙腈），最后采用3mL乙腈：乙酸銨（V：V=1：1）洗脫，取1mL洗脫液過濾，采用高效液相色譜串聯質譜儀檢測。

1.5降解條件的優化

培養溫度：設置培養溫度分別為15、20、2530、35和40C，孔雀石綠降解液體培養基初始pH為7.6，搖床轉速160rmin'，避光，在此培養條件下，測定菌株在48h后的降解率。

初始pH：設置孔雀石綠降解液體培養基的初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，恒定溫度30C，搖床轉速160rmin，避光，測定菌株在48h后的降解率。

不同初始濃度：設置孔雀石綠降解液體培養基中孔雀石綠的質量濃度分別為2、5、10、15、20304g：mL，分別接入處于對數生長期的菌液，在溫度30C、pH7.6、避光、搖床轉速160rmin'條件下培養，定時取樣測定菌株對孔雀石綠的降解率。

不同條件下的降解，均為孔雀石綠降解液體培養基中接入1%的處于對數生長期的菌液?？兹甘G在環境中易轉化為隱性孔雀石綠，試驗同時考查不同溫度和pH對隱性孔雀石綠降解的影響。試驗設置3個平行重復。

1.6菌株降解產物綜合毒性分析

采用發光細菌法，檢測降解菌株產物綜合毒性。發光細菌為可進行生物發光的一類細菌，該類細菌遇到有毒有害物質，其發光性受到抑制。相關試驗顯示，毒物濃度同菌體發光強度存在線性負相關關系，因此，發光細菌發光強度可作為毒物毒性大小的測定指標。目前利用發光細菌進行毒性評估已廣泛應用于環境科學的各個領域。

將菌株接種于孔雀石綠降解液體培養基中，于30C、160rmin搖床培養，分別于24h和7d后取樣，菌液8000r·min離心10min，取上清液通過水質生物安全測試儀進行毒性分析。發光細菌菌株為明亮發光桿菌，根據儀器獲得的發光值，計算發光細菌的抑制率，其抑制率的計算公式如下：

式中，X為抑制率;RL為暴露于樣品的明亮發光桿菌的發光強度;RLo為暴露于標準品種的明亮發光桿菌的發光強度。

1.7降解產物及降解途徑分析

為滿足孔雀石綠降解中間產物達到其在高分辨質譜儀的檢出要求，試驗過程中，適當提高MG的初始濃度，提高降解產物的回收、富集效率?；厥?、富集方法如下：分別在投加菌株后的第3、6、12和24h取樣，收集菌株對MG的降解液，采用二氯甲烷大量萃取降解產液中的代謝產物，萃取液合并后旋蒸，使用1mL甲醇溶解，過濾裝并瓶，采用LTQOrbitrapXL高分辨質譜進行降解產物分析，設置無添加菌樣品和純菌體培養液為兩個空白對照。

2結果與分析

2.1孔雀石綠降解菌Citrobacter sp.D3的分離、篩選及特性分析

經分離、篩選，獲得一株具有高效降解孔雀石綠藥物的菌株，命名為D3。其生物學特征為：革蘭氏染色陰性，桿菌（圖1），鳥氨酸脫羧酶試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、尿素酶試驗、精氨酸雙水解試驗、明膠液化試驗陰性，甘露醇試驗、山梨醇試驗陽性，可以利用葡萄糖、乳糖、蔗糖。在固體培養基上，菌落圓形、凸起，中等大小，邊緣整齊光滑，呈灰白色，半透明。

以菌株D3的基因組DNA為模板，以細菌16SrDNA通用引物進行PCR擴增，PCR產物測序后在GenBank上登錄，序列號為MG201776，經BLAST同源性比對發現，該菌株的16SrDNA與檸檬酸桿菌屬相似度最高，進一步結合形態學和生理生化特征可初步鑒定該菌株為檸檬酸桿菌（Citrobacter sp.）。

2.2菌株降解條件的優化

2.2.1溫度對菌株D3降解效率的影響溫度作為微生物生長及其代謝的重要因子，在適宜的溫度范圍內，微生物會表現出較快的生長及代謝速率，因此，試驗設置不同的培養溫度，考察不同溫度下菌株D3對孔雀石綠降解效率的影響，并同時考察降解菌對孔雀石綠代謝產物隱性孔雀石綠降解的影響。

由圖2看出，D3菌株在35C時對孔雀石綠具有最高的降解率，在低溫條件15～20C對孔雀石綠的降解率較低;菌株對隱性孔雀石綠的最高降解率在30C左右。降解菌對藥物的降解整體呈現隨著溫.度的升高降解率提高，溫度超過最適降解溫度，其降解效率降低，可能由于溫度對菌體生長及降解酶活性有影響，間接影響菌株對藥物的降解率。因此，選擇30～35C作為D3菌株對MG和LMG的最適降解溫度。

2.2.2培養液初始pH對菌株D3降解效率的影響

菌株在不同初始pH的培養液中的生長及降解效率如圖3所示。從圖中可以看出，D3菌株在偏酸性條件下，降解率較低，僅為15%左右，pH為8時獲得最高降解率，這與孔雀石綠降解菌EnterobacterB-20和Sphingomonaspaucimobilis，的最適降解pH較一致，這可能與高pH更適于孔雀石綠降解酶發揮作用有關。隨著堿性增強，菌株對孔雀石綠的降解率降低，因為隨著pH的升高，菌體生長受到抑制，導致降解率減弱，但其降解效率相對酸性條件仍較高，降解率約為46%。隱性孔雀石綠為孔雀石綠的酸性還原產物，從圖中數據顯示，D3菌株對隱性孔雀石綠降解的最適pH范圍較為寬泛，pH對LMG的降解影響不大，隨著pH值的增加，其降解率有所提升，在pH為4～10范圍內，降解率較為穩定，維持在60%～75%。綜上，選取pH為7～8作為D3菌株對MG和LMG的最適降解pH。

2.2.3培養液中藥物初始濃度對菌株D3降解效率的

影響將生長于對數期的菌液以1%的接種量接種至100mL孔雀石綠藥物初始質量濃度分別為2、10、15、20、30rg：mL的培養液中，分別在第12、24、48、72、4、5、9、10d檢測孔雀石綠的降解率。

由圖4可知，D3菌株對不同初始濃度孔雀石綠的降解率均隨時間的延長而增加，降解率達到最大值后隨著時間的增加，藥物的降解率不再增加，這可能是降解過程中不斷累積的代謝物質及環境中營養成分的耗損，對菌體的正常生長代謝產生影響，導致酶活性降低。結果顯示，較低初始濃度條件下，菌體在48h左右降解率達到最大值。隨著初始濃度的增加，菌體降解藥物的時間延長，且降解率降低，在質量濃度為30yg·mL的條件下，菌體降解率最高為20%左右，菌體OD600值非常低，說明高濃度的孔雀石綠對菌株的生長繁殖產生抑制，進而導致降解率降低。

2.2.4降解動力學分析采用一級反應動力學方程描述孔雀石綠降解過程，本試驗所用的動力學方程為：

式中，Ct為降解后t時刻殘留孔雀石綠的質量濃度（ug·mL”），Co代表孔雀石綠的初始質量濃度（ug*mL），t為降解反應時間（d），k為孔雀石綠降解速率常數（d'），tyn為藥物降解半衰期（d）。

采用D3菌株降解不同初始濃度條件下的孔雀石綠，降解試驗結果如表1所示。一級動力學方程的擬合度由R進行評價。結果表明，菌體降解孔雀石綠可以用一級反應動力學方程來描述，擬合曲線的相關系數在0.9169～0.9635。不同初始濃度對藥物的降解率影響較大，隨著初始濃度的提高，藥物的降解半衰期增加，且降解率下降。低濃度條件下，D3菌株對MG降解效果理想，降解率在85%以上，降解半衰期較短。在初始質量濃度較高的情況下，菌株降解效率較低，在30ug：mL條件下，藥物的降解效率僅為25.7%，且降解半衰期時間延長明顯。

2.3菌株降解產物綜合毒性分析

本試驗采用發光細菌法，研究D3菌株對孔雀石綠降解產物的綜合毒性，通過降解產物對明亮發光桿菌發光抑制率評價產物毒性。D3菌株對MG的降解產物在24h和72h對發光細菌的抑制率如表2所示。結果顯示，菌株對發光細菌的抑制率分別為0.2%和0.5%，說明D3菌株在生長過程中幾乎不會產生生物毒性，而初始質量濃度為5yg·mL的MG對發光細菌具有較高的抑制率，抑制率為50%以上，投加D3菌株后，菌株對MG的降解效果，24h時藥物抑制率降低10.9%，72h后抑制率再降低17.3%。結果表明，D3菌株在降解MG過程中可有效減弱藥物生物毒性，但降解混合液在72h對發光細菌仍具有約21.9%的抑制率，說明D3菌株在降解MG的過程中產生未完全分解的中間產物，中間產物對發光細菌仍具有抑制作用。

2.4菌株降解產物及降解途徑分析

菌體對藥物的降解主要依賴酶的催化作用，由于降解速度較快，降解過程產生的中間降解產物可能被迅速分解，為最大程度收集中間降解產物，獲得準確的藥物降解途徑，分別在菌體投加后的3h、6h、12h和24h連續取樣，不同時間段的降解產物混合后濃縮富集。

采用高分辨質譜儀對富集濃縮的降解產物進行質譜分析，高分辨質譜儀目前被廣泛應用于降解產物代謝途徑及其降解中間產物的分析8。試驗結果先經過空白扣除，再進行質譜圖分析，初步獲得MG的3種中間降解產物，分別為4二甲氨基二苯基甲酮（m/z=226.12）、N，N-二甲基苯胺（m/z=122.10）和4-二甲氨基-苯酚（m/z=138.09），其質譜圖和分子結構如圖5所示。根據MG和其3種降解產物的分子結構特征推測D3菌株降解MG的途徑如圖6所示。MG首先經過羥基化反應生成一個過渡中間產物孔雀石綠甲醇，該過渡中間產物氧化分解，獲得4-二甲氨基二苯基甲酮和N，N-二甲基苯胺，中間產物4-二甲氨基二苯基甲酮進一步分解，獲得次級代謝產物4-二甲氨基-苯酚和苯甲醛。

3討論

本研究從漁業養殖環境中分離得到的檸檬酸桿菌，可高效降解漁業生態環境中的孔雀石綠藥物殘留且其降解過程中代謝產物隱性孔雀石綠無明顯累積。該菌株生長溫度、pH范圍寬泛，具備較強的環境適應性，在pH為7～10、溫度為25C～40C條件下，菌株對孔雀石綠具備較高的降解效率，其降解率最高可達95%以上，并同時對孔雀石綠代謝產物隱性孔雀石綠具有較好的去除效果。目前，已有多株孔雀石綠降解菌被篩選出，如芽孢桿菌（Brevibacillus）、腸桿菌（Enterobacter）、拉烏爾菌（Raoultella）及假單胞菌（Pseudomonas）等四，但尚未見可同時去除孔雀石綠及其代謝產物的菌株報道，檸檬酸桿菌尚屬首次。通過對降解菌株的降解動力學分析，獲得菌株在不同初始濃度條件下的降解動力學參數，研究發現菌株在2～10yg·mL低濃度范圍，對孔雀石綠藥物具備較高的降解效率，降解率在85%以上，藥物質量濃度提高至30yg·mL1時，菌體生長受到抑制，其降解效率明顯降低，孔雀石綠在漁業養殖中治病、殺菌用藥質量濃度約0.15～2.00ug·mL”，用藥濃度不高，該降解菌株降解能力可有效解決殘留于漁業環境中的孔雀石綠藥物殘留。本試驗通過對降解產物的毒性分析，推測降解菌對孔雀石綠的降解產物仍存在部分毒性，并初步獲得3種降解中間產物，其中4-二甲氨基二苯基甲酮是MG脫掉一個苯環結構后主要的特征產物之一，該產物與已報道的多種菌株降解孔雀石綠的降解產物較為一致20，多數菌株降解MG均有此產物產生，說明其降解途徑具有相似性。產物N，N一二甲

基苯胺是生產MG的工業原料，也是合成MG的關鍵前體，該產物的出現可以推斷N，N-二甲基苯胺在MG生產上可重復使用。由于部分降解中間產物尚未找到，所以MG詳細的降解途徑有待進一步研究。目前國內外利用微生物降解孔雀石綠的研究較多，但是在微生物領域仍未有一個全面的關于MG降解途徑報告，本研究成功分離的3種特征產物可為MG的降解途徑研究分析填補理論。上的空白。如何將最終的降解產物完全轉化為無毒無害的物質，或為環境中的植物、生物菌群吸收代謝，是后期的一個重要研究方向。

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（責任編輯：張梅）

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