閃式提取法提取山藥中薯蕷皂素的工藝研究

趙明蕊 辛夢雨 任相蓮

1.河南醫學高等?？茖W校藥學系，河南新鄭 451191；2.鄭州大學藥學院，河南鄭州 450000

薯蕷皂素，又稱為薯蕷皂苷元（diosgenin），可由薯蕷皂苷水解而來，分子結構式見圖1，是合成甾體激素藥物的基礎原料和起始中間體[1-3]，而且有祛痰、降脂、抗炎、抗腫瘤等作用，具有較高的藥用價值[2-4]，山藥為薯蕷類作物[2]，從山藥中提取薯蕷皂素對綜合開發利用懷山藥，促進農民增收，幫助農戶脫貧致富具有一定的指導作用。目前，薯蕷皂素提取方法很多，主要是傳統的先水解后提取法，先提取后水解法，以及超臨界CO2法，表面活性劑法及改進的超聲波法等[1，4-6]，但大都在較高溫度或高壓下進行，且耗時較長，因此開發快速高效的提取方法具有較高的應用價值。已有研究表明，相比于索式提?。?.26%）及超聲提?。?.32%）的提取率，閃式提取法提取山藥中的薯蕷皂素，提取率高達0.50%[7]，但該研究未提及提取溶劑，且未對提取條件進行優化，在實踐中缺乏可操作性?；谇捌趯κ硎氃硭氐娜芙舛萚8]和超臨界提取方法的研究[9]，本實驗先對薯蕷皂素閃式提取法的提取溶劑進行選擇，再通過單因素實驗和正交實驗對工藝條件進行優化，獲得最佳工藝，以達到可實踐性強，且提取快速、高效、節能的目的，為山藥的進一步綜合利用提供理論依據。

圖1 薯蕷皂素的分子結構式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥（焦作溫縣）；乙醇、碳酸鈉、80%乙醇、石油醚（60～90℃）、高氯酸，均為分析純（天津科密歐化學試劑有限公司）；閃式提取器、刮膜閃蒸儀（北京金鼐科技發展有限公司）；循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠，RE-52AA）；紫外可見分光光度計（北京萊伯泰儀器有限公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多）；電熱恒溫水?。ㄉ虾Ｑ畼穬x器有限公司）；TDL-5-A型臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 薯蕷皂素的制備 取懷山藥，去皮，切片，干燥，加入含5%硫酸的提取溶劑后，用閃式提取器進行提取后，離心分離后，取上清液，加熱水解至規定時間，回收有機溶劑，冷卻，使用飽和碳酸鈉溶液中和，離心分離得到濾渣，將濾渣置于干燥皿在80℃烘箱中干燥，即得到水解物。

將上述干燥的水解物加入石油醚，用閃式提取器提取后，轉入旋轉蒸發器中，常壓回收石油醚至干，即得薯蕷皂素粗品。將上述粗品加20～30mL 95%乙醇加熱溶解。放置析出結晶，抽濾，移取結晶，烘干，即得薯蕷皂素精品[10]，計算得率。薯蕷皂素得率的測定：得率（mg/g）=提取的薯蕷皂素的質量（mg）/原料的質量（g）

1.2.2 薯蕷皂素含量的測定 根據參考文獻[11]稍加變化測定薯蕷皂素的含量。標準曲線的繪制：準確稱取薯蕷皂素標準品3.0mg，在105℃干燥至恒重，加石油醚于25mL容量瓶定容，混勻，作為標準溶液（0.12mg/mL）備用。精密吸取1、2、3、4、5、6mL的標準溶液于10mL帶刻度小試管中，揮發溶劑，加高氯酸10mL，置于30℃水浴中保溫15min，取出冷卻至室溫，測定吸光度A。標準曲線見圖2，求得回歸方程為A=0.152 95C+0.0618，其中C為薯蕷皂素濃度（g/L），A為吸光度，由圖2可以看出，薯蕷皂素含量和吸光度在0.12～0.62g/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數R2=0.9999。

圖2 薯蕷皂素濃度-吸光度標準曲線

按上述方法將制備的薯蕷皂素供試品配成溶液：準確吸取一定量供試品溶液于10mL比色管中，待溶劑揮發后，加高氯酸10mL，置于30℃水浴中保溫15min，取出冷卻至室溫，在410nm波長下測定吸光度，根據吸光度，稀釋至標準曲線的濃度范圍區間，并計算供試品中薯蕷皂素的濃度。

1.2.3 薯蕷皂苷提取溶劑的選擇 分別以乙醇+正丁醇（1∶1）[8]、80%乙醇[10]及70%甲醇[11]為提取溶劑對山藥中的薯蕷皂素進行提取，考察薯蕷皂素的得率。

1.2.4 薯蕷皂苷提取料液比的選擇 準確稱取山藥樣品25g置于閃式提取器中，分別控制提取溶劑體積與樣品的物料比1∶6、1∶8、1∶10、1：12、1∶14、1∶16，設定提取1次和提取時間2min，進行閃式提取。然后按照“1.2.1”項方法制備得薯蕷皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”項方法測定，計算薯蕷皂素得率。

1.2.5 薯蕷皂苷提取水解時間的選擇 準確稱取樣品25g置于閃式提取器中，加入250mL提取溶劑，設定提取時間2min，進行閃式提取。提取液加熱回流1、2、3、4、5h進行水解。然后按照“1.2.1”項方法制備得薯蕷皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”項方法測定，計算薯蕷皂素得率。

1.2.6 薯蕷皂苷提取次數的選擇 準確稱取樣品25g置于閃式提取器中，加入250mL提取溶劑，設定提取時間2min，進行閃式提取，提取次數為1、2、3次。每一次的提取液按照“1.2.1”項方法制備得薯蕷皂素精品。取一定量溶解，按“1.2.2”項方法測定，計算薯蕷皂素得率。

1.2.7 水解物薯蕷皂素提取條件的優化 以石油醚（60～90℃）為溶劑，進行閃式提取，根據初步試驗結果，考察石油醚料液比、提取時間、提取次數3個因素（每個因素確定3個水平）對山藥中薯蕷皂素得率的影響。按照正交實驗表L9（34）進行實驗，見表1，以薯蕷皂素得率為評價指標，進行直觀法和方差分析法分析其結果，以獲得山藥中提取薯蕷皂素的最佳工藝條件。

表1 正交實驗因素及水平表

2 結果與分析

2.1 薯蕷皂苷提取溶劑的選擇

以乙醇+正丁醇（1∶1）、80%乙醇及70%甲醇為溶劑時，山藥中薯蕷皂素的得率分別為5.08、7.65、7.41mg/g?？赡苌剿幹兄T多共存的其他成分，影響薯蕷皂苷在各種溶劑中的溶解性，而且薯蕷皂苷屬于甾體皂苷，在植物體內與糖結合成苷，極性較大，在80%乙醇及70%甲醇中溶解度較高，雖然經水解得到的薯蕷皂素（薯蕷皂苷元）極性較小，可能在乙醇+正丁醇（1∶1）溶解度會增加，但首先需要把薯蕷皂苷提取出來，才能獲得薯蕷皂素，從而提高薯蕷皂素的得率，因此選擇含水醇為提取溶劑。此外，雖然80%乙醇及70%甲醇為提取溶劑，薯蕷皂素的得率相差不大，但考慮到溶劑的毒性程度，選擇了80%乙醇。

2.2 薯蕷皂苷提取料液比的選擇

在閃提2min條件下，80%乙醇體積用量增加對薯蕷皂素得率的影響見圖3，結果表明，80%乙醇用量增加可以在一定程度提高薯蕷皂素的得率，但當體積增加超過250mL，80%乙醇體積用量的增加對薯蕷皂素得率的影響基本不會發生較大的變化，因此選擇料液比為1∶10。

圖3 薯蕷皂素得率隨80%乙醇體積用量的變化

2.3 薯蕷皂苷水解時間的選擇

在80%乙醇體積用量250mL，料液比1∶10情況下，閃提時間2min時，薯蕷皂素得率與閃提時間的關系見圖4，在2h時，得率已趨于穩定，隨著時間的增加，薯蕷皂素的得率略有下降，因為2h后皂苷已水解完全，在3、4h皂苷元得率處于一種平穩趨勢，也證明了反應已經基本完全，隨著水解時間的繼續增加，容易造成部分薯蕷皂苷元轉化成△3，5-雙烯的結構[1]。所以薯蕷皂苷水解2h為最佳水解時間。

圖4 薯蕷皂素得率隨水解時間的變化

2.4 薯蕷皂苷提取次數的選擇

以5%硫酸的80%乙醇溶液，提取薯蕷皂苷1、2、3次，每次提取液水解2h后，繼續后續操作，提取薯蕷皂素，其提取率分別為7.62、0.03、0.01mg/g，說明雖然提取2、3次還能繼續提取出少量薯蕷皂素，但經1次提取后，薯蕷皂苷已經完全提取?？紤]到能耗，選擇薯蕷皂苷提取1次。

2.5 正交實驗結果與分析

選擇提取因素A（料液比）、B（提取次數）、C[提取時間（min）]、D（空白）四因素的三水平做正交實驗，對薯蕷皂素得率（mg/g）結果進行分析，正交實驗結果見表2。

表2 正交實驗數據表

由表2數據方差分析可知，料液比和閃提次數對得率的影響顯著，閃提時間對得率影響較小。從正交實驗結果極差分析可知，最佳提取工藝為A2B3C1D2，即最佳工藝條件為料液比為1∶10，提取3次，提取時間2min。雖然提取第2次，第3次還能繼續提取出少量薯蕷皂素，但經1次提取后，薯蕷皂苷已經基本提取完全?？紤]到能耗，選擇薯蕷皂苷提取1次。

由結果可知，可利用薯蕷皂素不溶于水，易溶于有機溶劑的性質，利用石油醚進行提取，但單位質量薯蕷皂苷水解產生的薯蕷皂素的量是一定的，所以提取溶劑石油醚的用量并非越多越好，而是存在最佳值，即1∶10。

2.6 閃式提取的驗證實驗

按照選定的條件重復實驗3次，得率分別為8.15、8.16、8.11mg/g，平均值為8.14mg/g，均高于表中其他組合的得率，說明優化的薯蕷皂素提取工藝是合理的。

3 討論

薯蕷皂素的分光光度法測定，具有操作簡單、費用低、靈敏度高、重現性好等優點，且經過較系統的實驗研究表明，該法的測定結果與GC、HPLC測定結果基本一致[11-12]，因此本研究以高氯酸為顯色劑，用分光光度法測定其含量。

在中藥提取工藝中，與回流法、浸漬法、滲漉法、索氏提取法，超聲提取法相比，閃式提取法具有簡便、安全、節能、污染小及收率高等優勢[13-14]，被認為是一種既能促進中藥化學成分提取技術發展，又能加快中藥制劑的制取速度[15-16]，已被廣泛用于皂苷[16-17]、木脂素[18]、黃酮[19]、多糖[20]、油脂[21]等多種成分的提取。采用2次閃式提取法對山藥中的薯蕷皂素進行提取，最佳工藝條件為：5%硫酸的80%乙醇溶液，料液比1∶10，閃式提取1次，提取時間2min后，加熱水解2h，離心分離，取上清液，回收溶劑，收集殘渣，冷卻，使用1%碳酸鈉溶液中和，離心分離得到濾渣，將濾渣置于干燥皿在80℃烘箱中干燥，所得水解物以石油醚進行提取，此時的料液比為1∶10，再次閃式提取1次，提取時間2min，閃式提取器的主要理論依據是中藥組織內部的各種有效成分在合適溶劑的存在下，隨著高速粉碎與攪拌的外力，細胞組織碎裂、有效分子解離、使組織外圍溶劑溶解，從而形成新的平衡體系，迅速實現藥材組織內外有效分子濃度的均衡，進而達到快速提取的目的。本實驗使用2次閃式提取的優化方法，使薯蕷皂苷和薯蕷皂素的提取在數分鐘內即可完成，大大節約了能源；此外，本工藝的得率為0.814%，而未優化的閃式提取法得率為0.50%，也說明了本工藝的可行性。

酸水解法進行薯蕷皂素的提取的原理是通過強酸作用破壞植物細胞壁，從而破壞連接薯蕷皂素的皂苷鍵，水解生成苷元和糖類[22]。而直接酸水解時，因根莖中含量較高的纖維素和淀粉也被水解，硫酸消耗巨大，而且最后的酸水外排，造成環境污染。本研究的閃式提取，使用5%硫酸與80%乙醇溶液，在2min內即可快速破壞細胞壁，使薯蕷皂苷釋放到溶液中，且以乙醇為溶劑，又較大程度避免了纖維素和淀粉進入提取液，避免共存的雜質成分對薯蕷皂苷水解的干擾。此外，加熱提取液進行酸水解，使薯蕷皂苷在溶液狀態下水解，既可降低酸用量（從傳統的10%[10]降至5%），又可縮短水解時間（使薯蕷皂苷從文獻報道的最佳5.5h[1]，降低至本實驗的2h），而且在回收有機溶劑后的水溶液中，使用飽和碳酸鈉溶液中和，減少了酸排放。因此，閃式提取法提取薯蕷皂素是一種快速、高效、環保的提取方法，具有較高的應用價值。