含附子-半夏溫陽化痰湯對多囊卵巢綜合征大鼠的毒性研究*

余 婷，苗 青，王瑞海，許 京，陳 怡，朱莉莉，許紅英，張家瑋，肖 蘇，劉麗梅△

(1. 湖北省荊州市中醫醫院，湖北 荊州 434000；2. 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700)

溫陽化痰湯(藥物組成：黑順片、法半夏、陳皮、茯苓、甘草、蒼術、白術、白芥子、淫羊藿、皂角刺、絡石藤、巴戟、菟絲子、生山楂、神曲)是荊楚“劉氏婦科”奠基人、全國名老中醫劉云鵬用于治療多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)的臨床經驗處方。該方以反藥組合“附子-半夏”為君藥，用于臨床10余年療效顯著，并無不良反應出現。然而附子與半夏同用屬“十八反”配伍禁忌范疇，其能否同用歷來頗有爭議[1-2]，其用藥安全性值得探討。

研究發現，附子中主要的毒性成分為雙酯型二萜類生物堿[3]，半夏中的主要毒性成分可能為特殊晶型的草酸鈣針晶[4]。據報道，附子半夏配伍后，雙酯型二萜類生物堿的含量明顯增高，毒性增強[5]。實驗表明，附子-半夏藥對配伍用藥后對大鼠心臟有明顯的毒性反應，對腎臟和肝臟形態學也有影響[6]。因此，本研究在中醫理論的指導下，基于PCOS大鼠模型，探討溫陽化痰湯對附子-半夏毒性靶器官(心、肝、腎)的毒性作用，以評價該方安全性，為臨床安全用藥提供依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黑順片、法半夏、陳皮、茯苓、甘草、蒼術、白術、白芥子、淫羊藿、皂角刺、絡石藤、巴戟、菟絲子、生山楂、神曲均購自北京市雙橋燕京中藥飲片廠，批號分別為1609014、1609042、1609050、1610035、1609010、1607053、1607027、1512013、1608042、1610039、1603023、1608079、1608006、1609032、1606028，芙瑞來曲唑片購自浙江恒瑞醫藥股份有限公司，批號16113058。

1.2 儀器設備

AU480全自動生化儀(奧林巴斯株式會社，東京，日本)；Pannoramic 250 Pannoramic MIDI 病理切片掃描儀(3D HISTECH, Inc.，布達佩斯，匈牙利)；Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機(力康生物醫療科技控股有限公司，中國香港)。

1.3 動物

8周齡雌性SD大鼠，體質量(230±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2014-0013。本實驗已通過中國中醫科學院中醫基礎理論研究所實驗動物倫理委員會審查。

2 方法

2.1 中藥提取液的制備

溫陽化痰湯的制備方法：黑順片10 g加入8倍量水浸泡30 min，加熱煎煮30 min后加入已浸泡30 min的其他藥物，繼續煎煮30 min，趁熱過濾得濾液I；濾渣加入6倍量水煎煮30 min，趁熱過濾得濾液II；合并2次濾液加熱濃縮即得溫陽化痰湯，其生藥質量濃度為1.62 g·mL-1。

附子-半夏合煎液的制備方法：黑順片10 g加入8倍量水浸泡30 min，加熱煎煮30 min后加入已浸泡30 min的法半夏9 g，繼續煎煮30 min，趁熱過濾得濾液I；濾渣加入6倍量水煎煮30 min，趁熱過濾得濾液II；合并2次濾液加熱濃縮即得附子-半夏合煎液，其生藥質量濃度為0.171 g·mL-1。

2.2 PCOS動物模型的建立

圖1示，本實驗選用來曲唑誘導法建立PCOS大鼠模型[7-8]。正常飼養SD雌性大鼠，每天早上進行陰道涂片觀察細胞的周期變化(4～5 d)，完成連續2個正常動情周期的大鼠納入實驗，未完成完整動情周期的大鼠剔除。將參與實驗的大鼠隨機取出20只，其余大鼠建立PCOS模型：用溶于1%羧甲基纖維素中的來曲唑溶液按照每日1 mg·kg-1的劑量連續灌胃21 d，同時進行陰道涂片觀察，顯示動情周期無規律(即可見大量白細胞，偶見少量角化細胞，處于動情間期，提示無排卵，見圖1A)的大鼠為PCOS大鼠，動情周期規律(即可見大部分為角化細胞，處于動情期，見圖1B)的大鼠剔除。

注：A.大鼠處于動情間期；B.大鼠處于動情期圖1 大鼠陰道涂片比較(瑞氏染色 ×400)

2.3 大鼠分組與給藥

20只動情周期規律的正常大鼠按隨機數字表法分為正常組和溫陽化痰湯正常組各10只，分別連續4周灌胃生理鹽水和溫陽化痰湯水煎液；挑選30只造模成功的PCOS大鼠，按隨機數字表法分為模型組、溫陽化痰湯PCOS組和附子-半夏PCOS組3組各10只，分別連續4周灌胃生理鹽水、溫陽化痰湯水煎液和附子-半夏合煎液。

2.4 血液生化指標檢測

末次給藥后禁食12 h(不禁水)，分別對各組大鼠麻醉后取血，離心分離血清，用全自動生化儀分別檢測各組大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的水平。

2.5 主要臟器病理檢測

各組大鼠取血后，立即打開腹腔摘取心臟、肝臟和腎臟，以4%多聚甲醛固定，常規脫水，石蠟包埋、切片、HE染色，在光學顯微鏡下觀察各組織形態學變化。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 血液生化指標結果

圖2示，給藥4周后檢測各組大鼠血液生化指標。

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與PCOS組比較：△P<0.05；與溫陽化痰湯比較：#P<0.05，##P<0.01圖2 各組大鼠血液生化指標比較

(1)心肌損害指標CK-MB和LDH：與正常組比較，PCOS組和附子-半夏PCOS組大鼠血清中CK-MB和LDH含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與PCOS組比較，溫陽化痰湯PCOS組大鼠血清中CK-MB和LDH含量均降低，其中LDH降低顯著(P<0.05)；與溫陽化痰湯PCOS組比較，附子-半夏PCOS組大鼠血清中CK-MB和LDH含量均顯著升高(P<0.01)。

(2)肝功能指標ALT和AST：與正常組比較，PCOS組和附子-半夏PCOS組大鼠血清中ALT和AST含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；與PCOS組比較，溫陽化痰湯PCOS組大鼠血清中ALT和AST含量均顯著降低(P<0.05)；與溫陽化痰湯PCOS組比較，附子-半夏PCOS組大鼠血清中ALT和AST含量均顯著升高(P<0.01)。

(3)腎功能指標BUN和CR：與正常組比較，PCOS組和附子-半夏PCOS組大鼠血清中BUN和CR含量均升高，其中附子-半夏PCOS組升高顯著(P<0.05，P<0.01)；與PCOS組比較，溫陽化痰湯PCOS組大鼠血清中BUN和CR含量均降低，但差異無統計學意義；與溫陽化痰湯PCOS組比較，附子-半夏PCOS組大鼠血清中BUN和CR含量均升高，其中CR含量升高顯著(P<0.05)。

3.2 各組大鼠心肌組織病理學變化

圖3示，經HE染色后觀察各組大鼠心肌組織形態學變化，正常組大鼠心肌細胞排列整齊，細胞核清晰且位于細胞中央；模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，部分核仁消失，心肌纖維間隔增寬，可見部分肌纖維壞死，并伴有炎癥細胞浸潤；溫陽化痰湯PCOS組大鼠心肌纖維間隔及心肌纖維排列尚可，與模型組比較心肌病理損傷程度明顯減輕；附子-半夏PCOS組大鼠心肌細胞排列較為紊亂，部分發生彎曲呈波浪狀，心肌纖維增粗，與溫陽化痰湯PCOS組比較細胞間隙增大，橫紋消失，大量炎性細胞浸潤；溫陽化痰湯正常組大鼠心肌細胞排列紊亂，與正常組比較心肌纖維增粗細胞間隙變寬、橫紋模糊，伴有炎癥細胞浸潤。

3.3 各組大鼠肝臟組織病理學變化

圖4示，經HE染色后，觀察各組大鼠肝臟組織形態學變化，正常組大鼠肝細胞索呈放射狀整齊排列，無明顯炎性細胞浸潤；模型組大鼠肝細胞索排列紊亂，可見明顯的大泡性脂肪變性，匯管區膠原纖維顯著增生并向小葉內延伸，有較多炎細胞浸潤；溫陽化痰湯PCOS組大鼠肝細胞索排列較整齊，與模型組比較肝細胞脂肪變性明顯減輕，有散在的炎細胞浸潤；附子-半夏PCOS組肝細胞索排列紊亂，可見明顯的大泡性脂肪變性，中央靜脈周圍輕度水腫，并伴有炎性細胞浸潤；溫陽化痰湯正常組肝細胞排列紊亂，與正常組比較匯管區周圍膠原增生，有大量炎性細胞浸潤。

3.4 各組大鼠腎臟組織病理學變化

圖5示，經HE染色后觀察各組大鼠腎臟組織形態學變化，正常組大鼠腎小球無明顯病理改變，結構完整，毛細血管開放；模型組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，系膜區增寬，腎小管上皮細胞界限不清，少量細胞壞死，并伴有炎性細胞浸潤；溫陽化痰湯PCOS組大鼠腎小球結構無明顯異常，基底膜增厚程度顯著改善；附子-半夏PCOS組大鼠腎小球基底膜明顯增厚，系膜區增寬，系膜細胞高度增生，腎小管上皮細胞界限不清，胞漿疏松，少量細胞壞死；溫陽化痰湯正常組大鼠腎小球基底膜稍增厚，腎小管上皮細胞腫脹，胞漿疏松、淡染。

注：A.正常組；B.PCOS組；C.溫陽化痰湯PCOS組；D.附子-半夏PCOS組；E.溫陽化痰湯正常組圖3 各組大鼠心臟切片比較(HE染色，×200)

注：A.正常組；B.PCOS組；C.溫陽化痰湯PCOS組；D.附子-半夏PCOS組；E.溫陽化痰湯正常組圖4 各組大鼠肝臟切片(HE染色，×200)

注：A.正常組；B.PCOS組；C.溫陽化痰湯PCOS組；D.附子-半夏PCOS組；E.溫陽化痰湯正常組圖5 各組大鼠腎臟切片比較(HE染色，×200)

4 討論

PCOS是婦科常見的內分泌疾病，以月經紊亂、不孕、多毛、肥胖、痤瘡、雄激素過高、雙側卵巢持續增大及持續無排卵為臨床特征，嚴重困擾著廣大女性患者[9]?，F代研究表明，中醫藥治療PCOS較西藥治療療效更顯著，且毒副作用較小。PCOS屬于中醫學“不孕”“月經稀少”“月經后期”“閉經”“癥瘕”“崩漏”等范疇[10]。劉云鵬行醫濟世80余年，對婦科有豐富的臨床經驗，認為腎虛是PCOS的根本病機[11]。通過長期的臨床觀察發現，脾腎陽虛夾痰濕型的PCOS患者居多，然而運用常規的溫補腎陽配伍化痰藥物組方治療臨床療效并不太理想。經過長期臨床實踐，師法仲景自創溫陽化痰湯。該方以附子-半夏共為君藥，辛開燥降，相輔相成，散臟腑經絡、肌表上下的痰飲停滯，使陰寒得散、脾腎得溫、水濕得化、痰飲得消，則陽虛痰濁諸癥自除。該方雖含有反藥組合附子-半夏，但療效顯著并無不良反應出現，提示二者同用“相反”不是絕對禁忌。

CK-MB、LDH、ALT、AST、BUN和CR是目前診斷心臟、肝臟、腎臟疾病較常用的指標，其在血液中的含量可客觀反映各臟器細胞損傷的嚴重程度，對于臨床診斷具有重要的參考意義[12-14]。在本實驗中，由血液生化指標檢測結果發現，PCOS大鼠各指標水平均高于正常大鼠，表明PCOS對大鼠的心、肝、腎造成損傷，特別是對心和肝的損傷較嚴重；與模型組比較，附子-半夏PCOS組大鼠各指標水平顯著升高，表明附子-半夏反藥組合會進一步損傷心、肝、腎；與模型組比較，溫陽化痰湯PCOS組大鼠各指標水平降低，表明溫陽化痰湯可通過降低血清酶水平起到保護PCOS大鼠臟器的作用，同時也說明附子-半夏反藥組合經配伍后對PCOS大鼠臟器的損害程度減弱；與正常組比較，溫陽化痰湯正常組大鼠各指標水平升高，表明其可造成正常大鼠的臟器損傷。

經過顯微病理學觀察分析發現，與溫陽化痰湯PCOS組大鼠比較，附子-半夏PCOS組大鼠的心臟、肝臟和腎臟形態學均可見明顯的變化；與PCOS大鼠比較，正常大鼠經溫陽化痰湯干預后，其心臟和肝臟形態學發生明顯改變，均可見不同程度的損傷，腎

臟形態學改變不明顯。結果表明，附子-半夏反藥組合可嚴重損傷PCOS大鼠的臟器組織，但在復方中經配伍后對臟器的損害程度明顯減弱；溫陽化痰湯對正常大鼠的臟器組織可造成明顯損傷，特別是對心肌細胞和肝細胞，但可緩解PCOS大鼠各臟器組織的病理變化；組織病理學的結果與血液生化指標的檢測結果基本一致。

綜上所述，在病理條件下附子-半夏反藥組合在溫陽化痰湯中的毒性降低；溫陽化痰湯對PCOS大鼠未見明顯毒性，對正常大鼠的毒性明顯高于PCOS大鼠。由此可見，附子-半夏反藥組合在復方中經配伍后其毒性會降低，體現了中藥配伍減毒的特點；同時，溫陽化痰湯的毒性在生理和病理狀態下的動物中表現出較大差異，體現了明代著名醫家張景岳在注釋《素問·六元正紀大論篇》中提到的“有病則病受之”[15]的觀點。本實驗結果提示，在特定的病理條件下，附子-半夏反藥組合在一段時間內、一定劑量范圍內可與其他中藥組成方劑使用。