南瓜色素的制備及抗氧化作用機制研究進展

胡煒 陳天鑒 錢穎聰 林藝涵 阮依莉 張擁軍

摘? ? 要：南瓜中含有的南瓜色素是一類安全、著色力強且兼有營養保健功能的天然色素。筆者綜述了南瓜色素的理化性質，包括南瓜色素的顯色特點、脂溶性、穩定性與結構;南瓜色素提取與純化的制備工藝，主要是β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素及葉黃素;南瓜色素的檢測方法，包括分光光度法及色譜法;以及南瓜色素抗氧化性的作用機制及其在醫藥、保健領域的應用，并對南瓜色素分子結構鑒定方法、抗氧化應激作用的機制及結構與活性間的構效關系等提出展望，以期為南瓜色素的深化研究提供思路。

關鍵詞：南瓜色素;理化性質;提取純化;抗氧化

中圖分類號：S642.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2020）09-001-06

Abstract： Pumpkin pigment is a kind of natural product with safety， strong coloring power and nutritional and health care functions. In this paper， the physical and chemical properties of pumpkin pigment were reviewed， covering the color characteristics， fat solubility， stability and structure， as well as the preparation process of extraction and purification of pumpkin pigment. Finally， the mechanism of antioxidation of pumpkin pigment and its application in the fields of medicine and health care were also reviewed. The prospect is put forward to provide ideas for deepening the exploration of pumpkin pigment.

Key words： Pumpkin; Pigment; Physicochemical properties; Extraction purification; Antioxidant

南瓜（Cucurbita）可分為中國南瓜（C. moschata D.）、印度南瓜（C. maxima D.）和美洲南瓜（C. Pepo D.）。其栽培歷史悠久，根系發達，再生能力強，對土壤濕度無嚴格要求，適應性強，產量高，是世界范圍內種植的經濟重要物種。南瓜色素是一種少有的著色力強的理想天然色素，它克服了天然色素著色力不如人工合成色素的缺點，在很多方面能夠得到應用。南瓜色素主要成分為脂溶性的類胡蘿卜素，是使其果肉呈現強烈的黃色或橙色的原因。相較于同樣應用于食品工業中的水溶性天然色素——花青素而言，類胡蘿卜素具有抗氧化性的同時，著色力及穩定性都優于花青素[1-2]。雖然類胡蘿卜素在蔬菜水果中很常見，但南瓜中的類胡蘿卜素含量、種類都居于前列且較穩定。南瓜中主要的類胡蘿卜素包括α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質等[3-6]。根據宋新娜等[7]對美國140種食物類胡蘿卜素含量的歸納總結，南瓜中所含α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃質分別為8.34、42.26、34.71 μg·g-1，在140種食物中位列前十。此外，南瓜色素主要營養價值來自于其抗氧化能力和能夠作為重要營養物質維生素A的前體，其中E-β-胡蘿卜素具有100%的維生素A原活性[8]。通常情況下，黃色、橙色、紅色的果蔬中全反式結構的β-胡蘿卜素含量較高。Carvalho等[8]研究了2種長白南瓜，發現所有E-β-胡蘿卜素均為A和B樣品中質量分數最高的異構體，分別為244.22、141.95 μg·g-1，占β-胡蘿卜素總量的80%左右。Carvalho等[9]發現去皮的C. moschata中含有235 μg·g-1的E-β-胡蘿卜素，都高于Donado Pestana[10]等研究的同樣作為β-胡蘿卜素重要來源的CNPH 1194甘薯（128.5 μg·g-1）。一般認為，E-β-胡蘿卜素活性高于Z-β-胡蘿卜素，汪之頊[11]的研究表明，β-胡蘿卜素在部分中國成人體內轉化成維生素A的比值為質量比9.1∶1，順式結構的維生素A原活性約為其反式的一半[12]。它們具有的生理功能包括預防心血管疾病、白內障和衰老等。南瓜色素因具有此類營養特性和保健促進作用，是開發新型功能性食品、營養制劑和藥物制劑的理想成分，可在食品、保健、醫藥等領域中得到充分應用[13-15]。筆者歸納總結了國內外對南瓜色素理化性質、提取純化及其抗氧化性的研究現狀，以期為南瓜色素在食品的加工生產、飼料生產與醫藥行業等應用中提供理論基礎，進而開拓南瓜色素的市場。

1 南瓜色素的理化性質

1.1 南瓜色素的著色特點

南瓜色素是一種經提取、純化、濃縮南瓜皮或南瓜果肉得到的黃色天然食品級色素。而南瓜色素中的類胡蘿卜素是大部分南瓜主要呈黃色或橙色的原因，它在南瓜中的含量與成分組成因南瓜種類的不同而有所差異。從結構上看，類胡蘿卜素主要由8個異戊二烯以及它們在分子間形成的共軛雙鍵構成，這些偶聯的雙鍵結構使之主要呈黃、橙和紅色。共軛雙鍵的長度不同是產生顏色差異的原因，主要表現為吸收波長隨共軛雙鍵數量的增加向可見光區轉移。

1.2 南瓜色素的溶解性

類胡蘿卜素在蔬菜水果中很常見，而在南瓜中尤為豐富。南瓜中的類胡蘿卜素是一種脂溶性的在芳香烴、脂肪烴、氯代烴等有機溶劑中能夠溶解的四萜化合物，并且在極性較強的有機溶劑中溶解度較大。由于其疏水性與脂質組分有關，大多數類胡蘿卜素都有1個或2個環結構，由末端基團的環化形成。

1.3 南瓜色素的穩定性

類胡蘿卜素含有共軛雙鍵長鏈，因而對光、氧、酸與高溫敏感，氧化劑、金屬離子等也會有所影響。孫明奇等[16]對柑橘果皮類胡蘿卜素研究發現，在光、熱、氧化劑和低pH條件下，類胡蘿卜素容易降解，且隨著溫度上升、光照增強、氧化劑濃度增加及pH降低，降解作用加強。李曉銀[17]研究柿果皮類胡蘿卜素發現，當有二價和三價鐵離子、鋁離子、銅離子等存在時，類胡蘿卜素容易被破壞，但破壞程度不同。邵金華等[18]以柚皮類胡蘿卜素為研究對象，發現類胡蘿卜素在高堿性環境中不穩定，而還原劑、防腐劑與甜味劑對它無明顯影響。

南瓜色素是具有南瓜香甜氣味且易潮解的橙黃色粉末，能夠在乙醇、石油醚、丙酮等有機溶劑中溶解，其中，乙醇是最優溶劑。當pH為4～12時，酸堿性對南瓜色素影響不大，但當pH過低時會將其破壞。南瓜色素對光、熱的耐受性較強，但光照時間過長或溫度高于80 ℃會發生降解[19]。當金屬離子濃度較低時，色素不受影響，濃度過高則會使色素沉淀。南瓜色素具備一定的抗氧化性與抗還原性，但雙氧水等高濃度氧化劑會使其消色。在氯化鈉、蔗糖、碳酸鈉等常見食品添加劑存在的情況下，色素較穩定，枸櫞酸鈉可以使其增色，維生素C會使其消色。南瓜色素沒有毒性，LD50為5 010 g·kg-1，不僅能應用于食品與化妝品的著色，還可用于保健品、藥品中，且色素隨濃度的不同，可呈現出紅色到黃色這一范圍內的所有顏色，染色范圍十分廣泛。

1.4 南瓜色素的結構

南瓜色素中的主要色素類胡蘿卜素由異戊二烯構成，兩個異戊二烯在中間尾—尾相聯，首尾兩個異戊二烯組成六元環結構，形成共軛雙鍵長鏈。一般類胡蘿卜素能夠分成2種：烴類胡蘿卜素和含氧衍生物。前者只含碳氫，后者除碳氫外還含有氧。而南瓜中的烴類胡蘿卜素以α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素為主，含氧衍生物主要為葉黃素，結構如圖1所示[20]。

類胡蘿卜素的結構最特別之處在于由長系統的п電子對所形成的一個共軛體系，因為碳碳雙鍵、碳碳單鍵的存在，使類胡蘿卜素分子具有很明顯的立體異構特性。這種特性決定了類胡蘿卜素的分子形狀、化學反應性、吸光性以及顏色。多烯鏈上的每個雙鍵都有兩類幾何構型，即順、反式異構體（圖2）。一般，類胡蘿卜素的構型為全反式?，F今包括我國在內的各個國家側重于南瓜色素的特性研究，對其結構和組分的近探究比較少見。

2 南瓜色素制備方法

2.1 南瓜色素的提取

經高效液相色譜分析試驗[21-22]，南瓜色素主要由3種類胡蘿卜素組成，分別為葉黃素、β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素。

2.1.1 β-胡蘿卜素的提取 南瓜色素的主要成分為β-胡蘿卜素，又稱維生素A源，除可作為著色劑外，也可作為營養增補劑[23]。敬大江等[24]采用質量分數為0.7%的二水氯化鈣溶液處理，然后再以固液比1∶8～1∶15的石油醚作為溶劑對南瓜中的β-胡蘿卜素進行萃取，提取率可達85%。于開源等[25]采用復合溶劑對南瓜中的β-胡蘿卜素進行提取分離，利用響應分析法對提取條件進行優化，得出提取的最優參數為石油醚用量40 mL、溫度40 ℃、時間93 min，得到β-胡蘿卜素的質量濃度是10.086 μg·mL-1。試驗所得最優的復配溶劑為石油醚、乙醇、水，其中乙醇∶水的最佳體積比為1∶2。β-胡蘿卜素萃取率受溫度和石油醚用量的影響較大，受萃取時間影響較小;β-胡蘿卜素萃取率的曲面效應受時間與石油醚用量、溫度與石油醚用量的交互影響明顯。溶劑提取法不需要復雜的操作技術和設備，但所需提取時間較長，獲得的β-胡蘿卜素純度較差，需要進一步純化。

2.1.2 α-胡蘿卜素的提取 可采用溶劑提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取等方法。使用這些方法提取時，往往得到的是β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、葉黃素等南瓜色素的混合物。趙二勞等[26]以95%乙醇作浸提劑，經過單因素與正交試驗，得出南瓜色素的最優提取參數：超聲功率80 W、提取時間40 min、料液比（g·mL-1）1∶10。由此，粗提的色素提取率達到10.6%。超聲波輔助法減少耗時、提高效率、降低能耗，而且在低溫下也可進行。夏麗麗等[23]運用該法提取南瓜中的β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、葉黃素等，經過正交試驗獲得最優參數為：以95%乙醇為提取劑，料液比（g·mL-1）1∶60、微波功率640 W、提取時間3 min。相較于傳統水浴提取法，該法溶劑消耗量更少、加熱快、受熱均勻、耗時短，且提取率提高。

2.1.3 葉黃素的提取 南瓜中的葉黃素可以通過超臨界二氧化碳萃取，超臨界二氧化碳萃取是一類以CO2為提取溶劑的提取辦法。在定溫定壓前提下，CO2呈現超臨界流體狀態，兼具氣體的流動性與液體的溶解性[25]，可將葉黃素提取出來。徐麗萍[27]用該法提取‘紅蜜南瓜中的葉黃素，獲得的最佳參數是：溫度40 ℃、壓力15 MPa、時間4 h、CO2流量20 kg·h-1，由此得到的提取率為88%。超臨界二氧化碳萃取具有提取率高、損失少、有機溶劑不殘留等優勢，且CO2氣體易得，價格低廉，沒有毒性[28]，具有較低臨界溫度和壓力[29-31]，避免了傳統的沸點溶劑對色素結構和功能的破壞[32]，該技術已在食品、香辛料、醫藥等領域得到廣泛應用。

2.2 南瓜色素的純化

2.2.1 β-胡蘿卜素純化 β-胡蘿卜素可采用柱層析的方法純化，又因其極性小，故也可用石油醚進行純化。胡朝輝等[33]從極大螺旋藻中提取純化β-胡蘿卜素時采用體積分數為3%的乙酸乙酯和石油醚洗脫，通過氧化鋁柱進行色譜分析，平均回收率為96.8%。夏薇等[34]采用以硅膠為吸附劑的層析柱，石油醚為單一洗脫劑，從霉煙或碎煙末浸膏中純化β-胡蘿卜素，去除脂溶性雜質包括葉黃素和α-胡蘿卜素，回收率達到80%。

2.2.2 α-胡蘿卜素純化 α-胡蘿卜素純化可以采用柱層析和紙層析的方法。徐杰等[35]從貴州黑糯米稻米種皮中純化α-胡蘿卜素，先采用以硅膠為吸附劑的硅膠柱，以BAW上層（正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶5）為洗脫劑;再將硅膠得到的色帶洗下濃縮，經濾紙作紙層析分離，以BAW上層為展開劑，分離純化色素，得到α-胡蘿卜素質量分數為1.80 μg·g-1（鮮質量）。

2.2.3 葉黃素純化 葉黃素純化可以采用柱層析的方法，當需要純化的物質種類少、分子結構差異大（如葉黃素和胡蘿卜素）時，可以利用其溶解性差異來進行分離[36]。汪廷彩[37]采用柱層析的方法對葉黃素進行純化，上層為硅膠和活性氧化鋁，作為保護填充;下層為硅膠，作為主層析柱。先用三氯甲烷溶解，去除水溶性雜質，再用正己烷去除脂溶性雜質，包括β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素等，最終得到平均得率85.4%、純度為92.5%的葉黃素純化品。

3 南瓜色素的檢測方法

3.1 分光光度法

杜詠梅等[38]對樣本中葉綠素和葉黃素進行酯皂化，再用乙醚分離，減小其他色素或化學成分的干擾，最后將萃取出的類胡蘿卜素配制成不同濃度的溶液在445 nm下測量吸光度，得出類胡蘿卜素溶液濃度與吸光度呈線性關系，因此，利用分光光度法定量檢測類胡蘿卜素具有可行性。分光光度法操作較簡便，不需價格高昂的設備，更適合定量檢測類胡蘿卜素，但結果的精密度較低，需要優化試驗條件，而且南瓜色素是由多種色素構成的復雜色素，缺少標準品，用分光光度法對其進行準確定量仍需進一步探究。

3.2 色譜法

色譜法包括薄層色譜法、高效液相色譜法（HPLC）等，既可用于定性分析，也可用于準確定量。郭慶啟等[39]采用紙色譜法，展開劑選用水-濃鹽酸-甲酸（體積比為51.4∶24.9∶23.7），試驗測量并計算得出Rf值，并與標準值進行比對，得出黑加侖果渣花色苷主要包括矢車菊色素與飛燕草色素。顏少賓等[40]通過HPLC法檢測桃果實中類胡蘿卜素成分及含量，結果發現，色素含量由高至低依次為β-胡蘿卜素、玉米黃素、α-胡蘿卜素、β-隱黃質、葉黃素。吳增茹等[41]采用HPLC法測定國內外共31種南瓜中的β-胡蘿卜素，得出不同種類南瓜中該色素質量分數有較大區別，平均為9.52 μg·g-1（鮮質量）。其中，HPLC法檢測速度快、靈敏度高及樣品用量少，近年來使用較多，但操作較復雜，設備昂貴。

4 南瓜色素的抗氧化性

南瓜色素是一種具有生物活性、可作為抗氧化劑使用、含有共軛雙鍵系的萜烯基團類天然色素，它能夠影響細胞生長調節、調節基因表達和免疫反應[42]。近年來，對于花青素等的抗氧化性研究較多，而目前國內外對于南瓜色素的抗氧化能力尚不明確。但南瓜色素的氧化應激反應與花青素等的抗氧化性研究存在共通性，可以參考花青素這類色素的抗氧化性的研究方法對南瓜色素進行研究，可通過體內、體外試驗探討其作用機制。體外試驗包括羥自由基（·OH）和DPPH自由基（DPPH·）清除能力測定等，體內試驗包含線蟲、大鼠和小鼠試驗。其中線蟲試驗利用的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans）目前備受關注，它具有結構簡單、繁殖量大、方便觀察等特點，且大多與人體病狀有關的基因和通路涵蓋在線蟲基因組中。在秀麗隱桿線蟲上進行南瓜色素抗氧化性的研究，便于觀察，應用線蟲模型的研究結果也可以外推到人類[43-44]。

4.1 清除自由基

南瓜色素中的類胡蘿卜素由于電子轉移機制或可能的加成反應能與自由基作用。經由這種方式，類胡蘿卜素將會防止細胞損傷和氧化應激[45]。南瓜色素中具有的多個共軛多烯雙鍵使之與含氧自由基不可逆地形成穩定的碳中心自由基，并可逆地與氧作用產生一類新型過氧化自由基鏈。正常的生理代謝過程中會有少數含氧自由基在人體中生成，并會很快被人體中的抗氧化酶或抗氧化劑去除，通常對細胞、組織沒有損害。然而，氧分壓很大程度上影響了這個可逆反應的速率。在氧分壓減小的情況下，反應會朝碳核自由基方向進行，使人體中過氧化自由基含量減少，阻礙自由基的鏈鎖反應。此外，β-胡蘿卜素的穩定性使其在極低的氧分壓下依舊可以防止形成過氧化自由基鏈[46-47]。鄧麗君等[48]利用ABTS法、DPPH法及FRAP法對光合細菌中類胡蘿卜素進行試驗驗證，自由基可被類胡蘿卜素清除，且各分色素清除力有差異，然而都大于總色素的清除力，可能是不同分色素的結構相互影響導致總色素的抗氧化能力反而下降。

4.2 淬滅單線態氧

南瓜色素中的類胡蘿卜素屬于萜烯基團類中含有多個共軛雙鍵的不飽和化合物，是一種單線態氧淬滅劑，能阻止自由基進一步產生。三線態類胡蘿卜素（3CAR）可通過與溶劑質檢的振動與旋轉來淬滅三線態光敏物質（3S）和單線態氧（1O2），生成光敏物質（S）和基態氧。趙文恩[49]采用超微弱發光測量儀于710 nm下測定H2O2-NaOCl體系中的1O2發光，探究類胡蘿卜素猝滅1O2，發現該過程為物理機制，類胡蘿卜素在作用后結構并未發生改變，經過能量轉移仍可淬滅更多單線態氧和三線態光敏物質。反應式如（1）和（2）。

4.3 抑制過氧化效應

生物體內抗氧化酶活性隨著年齡的增長或因某些病理狀態而降低，而機體內氧化劑（如ROS）的產生增加，因此兩者失去平衡會引起氧化應激反應。氧化應激反應是一種重要的病理生理狀態，它會氧化損傷許多生物大分子，形成氧化物或過氧化物，從而損傷酶、細胞膜、組織和基因，因此損害細胞的完整性及功能進行性，引發心臟病、癌癥、衰老等。許多研究報道了各種類胡蘿卜素具有非常有效的過氧化自由基的淬滅能力，尤其是那些導致脂質過氧化反應的類胡蘿卜素，但其機制尚不明確。

細胞內存在多種機制可以產生活性氧，此類活性氧能使DNA斷裂、導致脂質過氧化、改變酶活性等。許多研究表明，此類由活性氧引起的氧化損傷可被類胡蘿卜素抑制，但起作用的關鍵性基團尚不明確。所以應研究南瓜色素的結構，對其產生作用的基團進行試驗驗證[50]。

5 小結與展望

類胡蘿卜素作為一種生物抗氧化劑對人體非常有利。而南瓜是類胡蘿素含量最高的蔬果之一，生產成本低，資源極為豐富，易于貯存，因此圍繞其開展類胡蘿卜素研究尤顯必要。且由于人們日益推崇天然健康的生活習慣，該研究方向具有廣闊的市場應用前景，可進行更深化、系統的研究。

如今，國內不乏南瓜色素提取技術及優化的探究，然而還停留于淺層，缺乏系統、科學的歸納，更不用說投入到大規模生產中，與國外研究進展差距較大。且南瓜中的大部分色素尚未被鑒定或測量。其主要原因是目前還沒有從南瓜中定量提取色素的方法。開發簡單、快速、毒性小的南瓜色素的制備與測定方法是目前亟待解決的問題。除此之外，對南瓜色素進行分子結構鑒定、抗氧化應激作用機制研究及結構與活性間的構效關系探究等仍需深入。

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