基于p38MAPK通路的電針揚刺對全層皮膚缺損創面早期血管化及觸覺改善的影響

杜偉斌 陳榮良 胡華輝 鮑關愛 沈福祥 曹國平 王利祥 全仁夫

[摘要] 目的 探討基于p38MAPK通路下的電針揚刺法對大鼠全層皮膚缺損創面早期血管化及觸覺改善的影響。 方法 選擇健康SD大鼠40只，將其按隨機數字表法隨機分為4組，分別為模型組、電針組、抑制組和電針+抑制組，每組各10只。模型組制備全層皮膚缺損SD大鼠模型后每天只給予碘伏消毒包扎。電針組給予模型處理后，當日即開始電針揚刺治療，其后1次/d，共14次。抑制組在造模前10 min腹腔注射SB203580 5 mg/kg，其后1次/d。電針+抑制組在每次電針揚刺治療前10 min腹腔注射SB203580 5 mg/kg。術后每天對4組大鼠進行一般行為觀察，術后3 d、14 d對4組大鼠創面愈合面積，創面相關血管標志物（CD31、VEGF、vWF）和觸覺感知標志物CK20表達進行比較。 結果 ①一般行為：在精神狀況、反應能力、攝食量等方面，術后第2天4組均恢復至術前水平。②創面愈合面積：3 d后4組創面均有所愈合，但不明顯，差異均無統計學意義（P>0.05）。14 d后電針組的創面愈合面積比其他3組更高，且隨著時間推移，創面愈合面積逐漸提高，差異有統計學意義（P<0.01）。③創面相關血管標志物：電針組3 d創面CD31、VEGF、vWF表達量最多，而14 d表達量最少，與其他3組比較，差異均有統計學意義（P<0.01）。④觸覺感知標志物：14 d后電針組CK20的表達量相對較多，與其他3組比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 電針揚刺可抑制p38MAPK通路過度活化，提高創面CD31、VEGF、vWF和CK20表達，在整體上促進皮膚缺損創面血供與觸覺修復，最終加速創面愈合。

[關鍵詞] 電針揚刺;p38MAPK通路;創面修復;早期血管化;皮膚缺損

[中圖分類號] R246.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）27-0041-05

[Abstract] Objective To explore the effect of electroacupuncture and pricking based on p38MAPK pathway on early vascularization and tactile improvement of full-thickness skin defect wounds in rats. Methods Forty healthy SD rats were selected and randomly divided into 4 groups according to the random number table method， including model group， electroacupuncture group， inhibition group and electroacupuncture+inhibition group， with 10 rats in each group.? In the model group， SD rats with full-thickness skin defects were prepared and treated with iodophor for daily dressing. After the model was made in the electroacupuncture group， electroacupuncture and pricking treatment was started on the same day， and then once a day， with a total of 14 times. In the inhibition group， SB203580 5 mg/kg was injected intraperitoneally 10 minutes before the model was made， and then once a day. In the electroacupuncture + inhibition group， SB203580 5 mg/kg was intraperitoneally injected 10 minutes before each electroacupuncture treatment. Every day after operation， the general behaviors of the four groups of rats were observed. The wound area healing， and the expression of wound-related vascular markers （CD31， VEGF， vWF） and tactile perception marker CK20 at 3 d and 14 d after operation between four groups were compared. Results ①General behavior： The mental status， reaction ability， food intake， etc. of the 4 groups recovered to the preoperative level on the second day after surgery. ②Wound healing area： After 3 days， the wounds in all 4 groups healed a little， but not obvious， the difference was not statistically significant（P>0.05）. After 14 days， the wound healing area of the electroacupuncture group was higher than that of the other three groups， and the wound healing gradually increased with time， and the difference was statistically significant（P<0.01）. ③Wound-related vascular markers： After 3 days， the expression of CD31， VEGF， and vWF in the electroacupuncture group was the highest， while that on the 14th day was the least， which was statistically different from the other three groups（P<0.01）. ④Tactile perception markers： After 14 days， the expression of CK20 in the electroacupuncture group was relatively high and the difference with the other three groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion Electroacupuncture and pricking can inhibit the excessive activation of p38MAPK pathway， increase the expression of CD31， VEGF， vWF and CK20 on the wound surface， promote the blood supply and tactile repair of skin defect wounds on the whole， and finally accelerate the wound healing.

[Key words] Electroacupuncture and pricking; p38MAPK pathway; Wound repair; Early vascularization; Skin defect

皮膚作為人體與外界環境之間的第一道屏障，是免疫系統的重要組成部分[1-2]。臨床上各種原因（如創傷、燒傷、切割傷等）導致的皮膚面積缺損是目前臨床治療的難點之一[3-4]。皮膚的損傷修復是一個高度復雜、精密調節的由多種細胞參與、相互作用并受多種機制調節的過程[5-6]。其中創面血管的新生在組織修復中有重要意義，可以加速創面與周圍組織建立血液循環，獲取愈合所需的營養物質，因此如何實現快速血管化是皮膚創面修復領域的一大研究熱點。電針刺激是一種調動皮膚內源性電流、糾正創面內環境、加速創面修復的綠色療法，但其作用機制尚不明確[7-8]。本實驗基于p38MAPK通路，以電針揚刺為主要手段，觀察干預后大鼠皮膚缺損創面早期血管化及觸覺改善情況，從細胞增殖階段的創面相關血管標志物和觸覺感知標志物蛋白表達方面，探討基于p38MAPK通路下的電針刺激對創面修復的影響及可能的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體重（220±20）g，購自浙江中醫藥大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2017-0005，實驗動物使用許可證號SYXK（浙）2018-0012，SPF級分籠飼養，溫度20～24℃，濕度50%～70%，適應性飼養1周后進行實驗。CD31抗體（GeneTen，美國）;VEGF、vWF、CK20抗體（Gibco，美國）;SB203580抑制劑（selleck公司，美國）。

1.2 建立全層皮膚缺損模型

結合前期造?；A并參考Ansell[9-10]制備全層皮膚切除創面大鼠模型。SD大鼠常規飼養1周，造模前12 h禁食水，然后予2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射進行麻醉。麻醉達成后，SD大鼠俯臥位固定于解剖板，造模區以大鼠背部脊椎左側或右側2 cm處為中心，備皮范圍3.5 cm×3.5 cm，創面造模區1.5 cm×1.5 cm，用手術剪剪毛、脫毛膏脫毛處理，然后以生理鹽水沖洗、碘伏消毒、乙醇脫碘。以利刀切除創面造模區中心全層皮膚，深至皮下，制造皮膚全層切除模型。術后碘伏消毒、壓迫止血，分置清潔籠內單籠正常喂養，保持傷口干燥，防止傷口感染。

1.3 大鼠分組及處理

將40只健康SD大鼠，按隨機數字表法分為4組，分別為模型組、電針組、抑制組和電針+抑制組，每組各10只，所有大鼠喂飼標準飼料，預防創口感染。模型組制備全層皮膚缺損SD大鼠模型后每天只給予碘伏消毒包扎。電針組給予模型處理后，當日即開始予電針揚刺治療（選取創面中心一點和創面邊緣上下左右0.5 cm處正常皮膚各一點，給予毫針（0.20 mm×13 mm）針刺，不施針刺手法，然后連接韓氏治療儀進行治療，負極位于中心，正極位于四周，頻率2 Hz，輸出電流0.6～1.0 mA，以毫針出現輕顫為度，1 次/d，每次28 min。抑制組在造模前10 min腹腔注射SB203580 5 mg/kg，其后1次/d。電針+抑制組在每次電針揚刺治療前10 min，腹腔注射SB203580 5 mg/kg。

1.4 指標評價與檢測

1.4.1 一般行為學觀察? 實驗開始后每天觀察大鼠的精神狀況、反應能力、攝食量、攝水量及存活數等。

1.4.2 創面面積變化的測定? 用游標卡尺測量并計算各組術后3、14 d的創面面積，面積越小說明愈合越快。

1.4.3 免疫組織化學檢測? 采用免疫組織化學法檢測每組大鼠皮膚創面邊緣組織術后3、14 d的CD31及14 d的CK20蛋白表達。經過脫水、石蠟包埋等步驟，制成切片厚度為4 μm的標本。二甲苯脫蠟，梯度酒精復水，抗原修復，滴加一抗4℃冰箱孵育過夜后孵育二抗，中性樹膠封固后，鏡下觀察拍照，對樣本CD31、CK20的蛋白表達情況進行比較。

1.4.4 Western blot相關蛋白檢測? 采用Western blot法檢測每組大鼠皮膚創面邊緣組織術后3、14 d的CD31、VEGF、vWF蛋白表達。經過提取組織總蛋白、BCA法測定蛋白濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉、免疫反應（一抗和二抗孵育，β-actin作為內參）、化學發光（ECLA和ECLB兩種混合試劑顯色）、凝膠圖像分析等步驟，對樣本CD31、VEGF、vWF的蛋白表達情況進行條帶及灰度值比較，灰度以Image J軟件進行分析。

1.5 統計學方法

數據應用SPSS20.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般行為學觀察結果

實驗動物術后首日普遍精神較差，可能因麻醉、驚嚇等原因導致，后各組實驗動物攝食量、攝水量均不同程度好轉并均基本恢復至正常水平，無實驗動物死亡。

2.2 各組創面修復情況

術后3 d 4組創面均有所愈合，但不明顯，電針組與其他3組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）;術后14 d電針組的創面愈合面積大于其他3組，差異均有統計學意義（P<0.01）;隨著時間推移，各組組內比較，創面愈合面積逐漸增大，差異均有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2.3 免疫組織化學檢測情況

術后3 d電針組CD31陽性表達量最多，術后14 d電針組CD31表達量最少，與其他3組比較差異均有統計學意義（P<0.01）。術后14 d各組CK20表達量均較少，電針組與其他3組比較相對較多，差異均有統計學意義（P<0.05）。見封三圖2、表2。

[6] Ennis WJ，Lee C，Gellada K，et al.Advanced technologies to improve wound healing：Electrical stimulation，vibration therapy，and ultrasound-what is the evidence？[J].Plast Reconstr Surg，2016，138（3）：94-104.

[7] Bora KP，Gurcay E，Karaahmet OZ，et al.High-voltage electrical stimulation versus ultrasound in the treatment of pressure ulcers[J].Adv Skin Wound Care，2017，30（12）：565-570.

[8] Thakral G，Lafontaine J，Najafi B，et al.Electrical stimulation to accelerate wound healing[J].Diabet Foot Ankle，2013，16：4.

[9] Quan R，Zheng X，Xu S，et al.Gelatin-chondroitin-6-sulfate-hyaluronic acid scaffold seeded with vascular endothelial growth factor 165 modified hair follicle stem cells as a three-dimensional skin substitute[J].Stem Cell Res Ther，2014，20（5）：118.

[10] Ansell DM，Holden KA，Hardman MJ.Animal models of wound repair：Are they cutting it？[J].Exp Dermatol，2012， 21（8）：581-585.

[11] 杜偉斌，胡華輝，鮑關愛，等.皮膚創面兩種形式電刺激對加速修復作用的研究進展[J].中國中西醫結合外科雜志，2019，25（2）：217-221.

[12] Gomes RC，Guirro ECO，Gon？觭alves AC，et al.High-voltage electric stimulation of the donor site of skin grafts accelerates the healing process.A randomized blinded clinical trial[J].Burns，2018，44（3）：636-645.

[13] Maksimovic S，Nakatani M，Baba Y，et al. Epidermal merkel cells are mechanosensory cells that tune mammalian touch receptors[J].Nature，2014，509（7502）：617-621.

[14] Seung-Hyun W，Sanjeev R，Andy DW，et al.Piezo2 is required for merkel-cell mechanotransduction[J].Nature，2014，509（7502）：622-626.

[15] 杜偉斌，胡華輝，鮑關愛，等.基于MAPK信號轉導通路的電針治療相關疾病研究進展[J].中國中醫急癥，2019， 28（2）：1124-1128.

[16] Nan W，Xu Z，Chen Z，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells accelerate the hyperglycemic refractory wound healing by inhibiting an excessive inflammatory response[J].Mol Med Rep，2017，15（5）：3239-3244.

[17] Klein AM，Zaganjor E，Cobb MH.Chromatin-tethered MAPKs[J].Curr Opin Biol，2013，25（2）：272-277.

[18] 張萌，彭利，喬治斌，等.羅格列酮激活p38MAPK通路調控p53及p21影響人肝癌HepG2細胞周期[J].第三軍醫大學學報，2014，36（3）：240-243.

[19] 吳起，王甲漢，劉亮，等.p38絲裂原活化蛋白激酶和核因子-κB促進創面血管化的機制探討[J].暨南大學學報，2015，36（2）：131-135.

[20] 于楠楠，孫忠人.電針對大鼠壓瘡組織血管內皮生長因子表達的影響[J].中醫藥信息，2016，33（3）：81-84.

[21] 李超然，孫忠人，仇立波，等.電針傍刺對大鼠皮膚壓瘡Ang-1及Ang-2表達的影響[J].中醫藥信息，2015，32（5）：86-90.

[22] 杜偉斌，陳榮良，俆亦生，等.不同部位電針刺激對脊髓損傷性膀胱功能障礙影響的研究進展[J].中國中醫急癥，2017，26（2）：264-267.

[23] 全仁夫，胡華輝，黃小龍，等.電針秩邊穴和水道穴對急性脊髓不完全損傷大鼠腦皮質代謝物的影響[J].中醫正骨，2016，28（11）：801-806.

（收稿日期：2020-03-12）