ctDNA在可切除結直腸癌肝轉移中的應用

王真,劉燕文

(東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009)

隨著液體活檢的發展，循環腫瘤DNA(ctDNA)在腫瘤的篩查、監測復發、治療耐藥、預后等方面具有應用價值。ctDNA由腫瘤細胞釋放入血并且能保留其表觀遺傳學特征。結直腸癌最易發生轉移的部位是肝臟[1]，結直腸癌肝轉移切除與不切除生存率差異較大，但目前對于是否應該切除暫無統一的標準。作者擬就ctDNA在可切除結直腸癌肝轉移中應用的研究進展作一綜述。

1 可切除結直腸癌肝轉移介紹

部分結直腸癌肝轉移患者初始狀態或經過轉化治療后，可以評估為可切除。根據2019年CSCO指南，目前鏡下病理無殘余(R0)切除仍是最重要的治療手段，不可切除的則行姑息治療。手術切除及不可切除的結直腸癌肝轉移患者的5年生存率分別為42%和9%，10年生存率為25%和4%[2]，可見對于可切除患者應實行以手術為核心的綜合治療模式。結直腸癌肝轉移術前評估標準包括兩個維度：(1) 外科技術維度，足夠的殘留肝臟體積，手術切緣達到R0要求[2]；(2) 腫瘤生物學維度，從復發風險評分(CRS)、腫瘤病理信息、免疫組化、左右半結腸、化療敏感性等方面評估。但仍有部分患者R0切除術后出現早期復發，無病生存期(DFS)較短。同時手術切除及術后恢復都是對機體機能的消耗，將會影響患者后續生存質量及治療耐受性。因此，需要更多術前評估指標，篩選手術優勢人群，避免不必要的肝切除手術。

術后通過評估樣本的邊緣來確定手術切除結直腸癌肝轉移的根治性。外科手段的R0切除是達到無疾病狀態(NED)的手段之一，但是對于微小病灶評估仍存在不足。精準評估術后的NED是目前的一個難點。術后監測手段主要為體檢、腫瘤血清標志物癌胚抗原(CEA)檢測及胸腹盆的增強CT。但是目前血清腫瘤標志物存在敏感性較低的缺點；影像學檢查存在滯后性，也容易漏掃微小病灶。因此急切需要更多的評價指標幫助篩選手術患者以及進行術后評估監測，彌補現有監測手段的不足。液體活檢具有無創性、敏感性和動態性等優勢，有解決部分現存問題的潛力。其中ctDNA尤其值得關注，也是液體活檢目前的研究熱點。有多個研究表明ctDNA在結直腸癌早期診斷、監測術后早期復發、監測治療反應、治療耐藥、提供預后信息等方面具有應用價值[3]。ctDNA能否在結直腸癌肝轉移中成為一個可靠的預測指標值得關注。

2 ctDNA簡介

ctDNA占循環無細胞DNA(cfDNA)總量的一小部分，是腫瘤細胞釋放到血流中的150～200個堿基對片段，保留了表觀遺傳特征，并攜帶可在外周血中檢測到的腫瘤特異性突變[4]。ctDNA半衰期短，通常小于1 h，可以動態監測腫瘤的變化[5]。ctDNA可來源于腫瘤原發組織、轉移灶和循環腫瘤細胞。目前ctDNA主要的監測方法有靶向監測和非靶向監測。靶向監測如ddPCR，可以檢測同一樣本的多個突變，靈敏度高(0.05%～0.001%)，但其多路復用能力僅限于檢測5～10個不同的目標序列[6]。非靶向監測如下一代測序(NGS)，傳統的NGS的靈敏度為2%～5%，通過大規模并行測序可以同時檢測數百種分子異常，優化的NGS敏感度已提高[6]。ctDNA的敏感性要遠高于CEA，并能比影像資料更早預測治療反應及疾病復發。Young等[7]提出甲基化的ctDNA敏感性是CEA的2倍，在一項薈萃研究[8]中，ctDNA中Septin9敏感性遠超血清腫瘤標志物，特異性無明顯差異。目前ctDNA部分應用已進入市場階段。ctDNA可以指導晚期腫瘤患者的藥物選擇，如檢查非小細胞肺癌T790m突變、指導靶向用藥。Septin9基因甲基化可應用于結直腸癌的早期篩選中。

3 液體活檢ctDNA與組織活檢的一致性

組織活檢提示RAS和BRAF野生型的晚期結直腸癌患者Ⅰ級推薦化療加抗表皮生長因子受體(EGFR)治療[2]。RAS、BRAF基因有助于監測耐藥、提供用藥指導，同時它們也有預測預后的作用[9]。因此動態監測基因變化尤為重要，但組織活檢創傷大且較難多次獲得，而外周血ctDNA容易獲得。液體活檢與組織活檢相關性的評估很有必要。

Thierry等[10]對106例結直腸癌患者使用金標準組織活檢及定量PCR監測外周血ctDNA，結果發現BRAF V600E突變的特異性和敏感性均為100%，KRAS突變特異性為98%，敏感性為92%，一致性值為96%。Bachet等[11]研究發現，與腫瘤組織中的RAS狀態相比，僅使用NGS的準確率為83%，使用NGS加甲基化生物標志物分析的準確率為93%。在肝轉移患者中，兩種檢查聯合使用的準確率達到96%。目前，多個研究顯示ctDNA檢測到的突變與組織活檢突變的一致性較高[12- 13]。2019年在一項對結直腸癌KRAS突變與組織一致性的薈萃分析中合并的敏感性、特異性分別為63.7%、94.3%，外周血KRAS突變在特異性方面具有足夠的診斷效能[14]。

在一項關于肝周血液和外周血循環腫瘤細胞(CTC)對結直腸癌肝轉移切除術影響的研究中發現，肝周血液中CTC水平高與較短的DFS和較短的總生存期(OS)相關，而外周血CTC并不能預測預后。作者考慮外周血和肝周血液CTC的生物學可能存在差異[15]。Narayan等[16]進行了一項關于組織活檢、外周血ctDNA以及肝周血液ctDNA的臨床研究，檢測TP53、APC突變，提出外周血可以反映肝周ctDNA的信號，與組織活檢一致性高。

ctDNA與組織活檢的一致性較高，為液體活檢代替組織活檢提供了可能，可以通過對外周血ctDNA定量或者定性的分析，達到指導用藥和提供預后信息的目標。

4 外周血ctDNA在結直腸癌肝轉移中的應用

4.1 外周血ctDNA對結直腸癌肝轉移手術優勢人群的篩選

目前術前評估的因素有手術技術、CRS等方面，但是部分結直腸癌肝轉移患者術后很快出現復發，生存獲益低，此類評價體系可能對他們并不適用。Kemeny等[17]提出陽性的手術切除邊緣(R1)沒有發現對無復發生存期(RFS)有預測作用，但是組織中監測到KRAS突變的結直腸癌肝轉移患者的RFS降低。Margonis等[18]也得到類似結論，肝臟切除后存活率的差異是由于KRAS為野生型或突變型，而不是R0或R1切除。這強調了固有的癌癥生物學特征的作用，而不是切除邊緣。傳統的評估方式存在爭議，需要反映腫瘤特異性的新的生物標志物。同時組織活檢KRAS突變與外周血ctDNA的一致性較高。此外，He等[19]發現術前ctDNA水平與結直腸癌肝轉移的腫瘤負荷顯著相關，對復發有預測作用。Bhangu等[20]提出ctDNA甲基化的Septin9和AIT 47與腫瘤體積相關，Septin9能夠區分最終接受手術的患者。Lang等[21]也提出可以將RAS通路突變擴展到CRS中。在臨床上術前ctDNA的檢測可以成為參考因素，彌補傳統評估方法的不足。

Bidard等[13]收集了潛在可切除肝轉移患者治療前、系統治療1個月及肝手術前的外周血標本，ctDNA的評估局限于監測到KRAS2外顯子突變的患者?；€時監測到ctDNA的患者，R0/R1的切除率較低；經過4周的全身治療，ctDNA仍然可監測到的患者的R0/R1切除率低于未檢測到的患者(36%vs85%)；術前監測到ctDNA的患者生存期較短。這表明該生物標志物可以幫助決定肝臟手術是否適合患者。

術前ctDNA陽性患者與陰性者相比，根治率低、生存獲益較少，對后續化療耐受也有不良影響。對此類患者需要謹慎選擇手術，以便于患者獲得最佳的治療結局。

4.2 外周血ctDNA對結直腸癌轉移瘤切除術后NED的評估

外科根治性即R0切除包括病變組織的完整切除，根治性手術是潛在達到NED的手段，能夠有效提高患者5年生存率。術后ctDNA水平有望成為評估NED的新指標。Reinert等[22]發現1例患者術后外周血監測出ctDNA陽性，考慮手術并非根治性。Norcic等[23]提出對結直腸癌患者外周血中體細胞KRAS和BRAF突變的隨訪可能有助于評估疾病的手術清除。多個臨床研究[24- 25]表明，ctDNA可以監測到術后的微小殘余病灶。

Benesova等[26]在一項對47例轉移性結直腸癌患者的研究中發現，28例R0切除患者術后ctDNA檢測陰性26例(26/28,93%)。陽性患者中1例出現肝臟小轉移，射頻消融后患者繼續顯示ctDNA陽性，隨后在術后6個月被診斷為疾病復發。另1例患者是根治術后6個月通過影像學方法觀察到復發。這意味著ctDNA可以更加敏感地評估術后NED。Murray等[27]也發現術后血中ctDNA甲基化陽性的結直腸癌患者術后殘余病灶及復發的風險增加。

NED是個動態的概念，隨著液體活檢等新技術的發展，對NED的評估會越來越準確。術后ctDNA陽性提示根治術后仍可能存在微小殘留病灶。結合術后ctDNA水平可以更合理地選擇術后輔助治療的強度和時長以及制定術后隨訪的頻率，推動個性化精準治療的發展。

4.3 外周血ctDNA對結直腸癌肝轉移術后隨訪的評估

根據CSCO指南，對于Ⅳ期轉移瘤R0切除，Ⅰ級推薦隨訪/監測頻率：前3年每3個月1次，然后6個月1次至5年,5年后1年1次。隨訪的內容包括體格檢查、腫瘤指標CEA檢查、每6～12個月的胸腹增強CT、盆腔增強核磁[2]。如前所述，CEA敏感性較低，影像學檢查存在滯后性，ctDNA在術后監測中可以為早期發現復發轉移提供依據。

在早期結直腸癌根治術后監測中，有研究表明ctDNA陽性者的復發率是陰性者的40倍，比影像早16.5個月預測復發[25]，另一項臨床研究觀察到ctDNA監測到復發平均先于放射學和臨床證據3個月[28]。在一項230例早期結直腸癌標志物的前瞻性研究中，中位隨訪27個月，術后ctDNA陽性患者復發率為79%，ctDNA陰性患者復發率僅為9.8%[29]。術后ctDNA在Ⅱ期結直腸癌中提供殘留疾病的直接證據，確定復發風險極高的患者，在Ⅲ期結直腸癌中有望成為RFS的預后因素[30]。

Scholer等[31]提出與CT成像相比ctDNA平均提前9.4個月檢測到復發，23例肝轉移患者中術后3個月ctDNA陽性者復發率為100%，陰性者復發率為50%，術后3個月的ctDNA監測是非常強的預測復發因素。Benesova等[26]監測47例結直腸癌肝轉移術后患者，共22例出現復發，其中13例患者ctDNA、影像學及腫瘤標志物同時監測到復發。腫瘤標志物7次(32%)陰性，影像學檢查無腫瘤6次(27%)，ctDNA全部檢測到復發，其敏感性最高。4例患者(4/22,18%)僅用ctDNA檢測腫瘤復發，影像學方法及腫瘤標志物均為陰性。

術后的動態監測可以提示預后信息，有助于更早監測腫瘤復發，為盡早實現臨床干預創造條件。

4.4 外周血ctDNA在晚期結直腸癌的治療評估及靶向藥物“再挑戰”中的應用

RAS基因野生型的晚期結直腸癌患者可以從抗EGFR治療中獲益。有趣的是組織中監測到RAS突變，但血漿中未監測到，依舊可以從抗EGFR治療中獲得生存益處[32]。但是治療數月可發生耐藥性，耐藥性的產生與RAS通路突變的出現相關[33]。血漿ctDNA可以在影像進展發生前更早地監測到突變的存在[6]。由于RAS突變導致抗EGFR治療病情進展的患者，可能在脫離抗EGFR治療后重新獲得敏感性。在一項抗EGFR“再挑戰”治療的臨床研究中，患者緩解率為53.8%，中位無進展生存期為6.6個月[34]。Cremolini等[35]基于臨床回顧性研究提出西妥昔單抗和伊立替康的再挑戰策略可能對RAS和BRAF野生型晚期結直腸癌患者有效。組織二次活檢創傷較大，通過分析血漿ctDNA中RAS突變可以選擇適合“再挑戰”的患者[36]。此外，血漿ctDNA早期的濃度變化可以預測一線或二線的化療療效[37]。

5 總結與展望

在晚期結直腸癌中外周血ctDNA與組織活檢一致性較高，為液體活檢提供了理論基礎。目前關于術前ctDNA在結直腸癌肝轉移手術中篩選優勢人群的研究較少，文獻局限于個例或KRAS突變的患者，術前ctDNA水平高與手術根治率低、生存期較短相關。目前也有研究表明，R0、R1切除對于預后可能無明顯影響，反而是組織或者外周血中RAS突變影響預后。后續可以擴大樣本的數量，篩選合適的評價指標。在術后監測和隨訪中，ctDNA陽性提示根治術后也可能存在殘留病灶，存在快速復發的風險。術后隨訪監測ctDNA 也可以較現有檢查方法更早、更敏感地提示復發。ctDNA有望在結直腸癌肝轉移治療中提供全程動態縱向的評估，實現腫瘤的個體化精準治療，讓患者獲得更多的生存效益。

目前ctDNA的分離、檢測還沒有統一的標準，陽性的定義各個實驗室存在差異。需要開展更多、范圍更大的臨床實驗，制定統一的臨床標準。同時ctDNA在血漿中含量低，在cfDNA占比僅0.2%左右，富集困難，檢測費用較高，臨床推廣難度較大。有研究表明，在癌癥患者中長cfDNA片段的濃度比例較高[37]，Iwai等[38]發現，長鏈cfDNA/β-球蛋白值升高在結直腸癌肝轉移術后可以提示微小殘留病灶，預測早期復發。在臨床上部分ctDNA監測可以考慮由cfDNA代替，減少成本和處理時間，更容易推廣。ctDNA價值的確定需要更大規模的研究和標準統一的流程，液體活檢在腫瘤診療全過程擁有一個廣闊的應用前景。