亞油酸鈉刺激多環芳烴污染土壤微生物修復的機理研究①

袁 靜，王青玲，侯金玉, 張 杰，劉五星*，駱永明

亞油酸鈉刺激多環芳烴污染土壤微生物修復的機理研究①

袁 靜1,2，王青玲2，侯金玉2, 張 杰1，劉五星2*，駱永明2

(1 安徽師范大學生命科學學院，安徽蕪湖 241002；2 中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所)，南京 210008)

根系分泌物在多環芳烴(PAHs)污染土壤的植物根際修復過程中發揮關鍵作用，但是向土壤中單獨施入根系分泌物化學物質對PAHs去除的影響還少有研究。本試驗通過土壤微宇宙培養試驗和高通量測序技術研究了根系分泌物亞油酸鈉對土壤微生物群落及PAHs降解的影響。結果發現，60 d后，添加肥料與亞油酸鈉處理對土壤中PAHs的去除率為40.6%，顯著高于僅施肥處理的17.4%。主坐標分析(PCoA)表明添加亞油酸鈉顯著改變了土壤微生物群落，土壤細菌和真菌群落組成與僅施肥處理明顯分異。此外，亞油酸鈉的添加還促進了PAHs降解菌如、、和等細菌，以及、和等真菌的富集。LEFSe分析表明，、和是添加亞油酸鈉處理的主要微生物標記物，且和相對豐度與土壤中PAHs含量呈負相關。本研究結果初步揭示了亞油酸鈉強化土壤PAHs生物降解的機理。

多環芳烴；根系分泌物；亞油酸鈉；微生物群落

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是由兩個或者兩個以上的苯環以線形、角狀或簇狀方式稠合在一起的持久性有機污染物[1]。PAHs能夠通過土壤、水體、大氣、生物體進行長距離的遷移，具有生物毒性、生物蓄積性和半揮發性等特性，部分PAHs還有很強的致畸、致癌、致突變作用，故引起全球廣泛關注[2-5]。美國和歐盟將PAHs中的16種列為優先控制污染物，1990年我國也將7種致癌性PAHs列入中國環境優先污染物黑名單。

生物修復中的植物修復技術具有修復成本低、不引起二次污染并且在修復的同時能夠美化環境等特點，特別適合于大面積中低濃度PAHs污染土壤的修復[6]。由于土壤中的PAHs類污染物水溶性差，辛醇-水分配系數高，能被植物直接吸收的少[7]。因此對于PAHs污染土壤的植物修復，其修復機理主要是通過根系分泌物，選擇性地刺激植物根際與污染物降解相關的微生物生長，增強與PAHs降解相關的功能菌株活性的方式來降解PAHs[8-9]。有研究顯示在PAHs污染土壤中加入玉米、黑麥草、向日葵、三葉草等特定植物的根際分泌物后，土壤中PAHs類污染物的礦化速度明顯加快，同時隨著添加物濃度的增加，土壤微生物生物量碳、微生物呼吸商也相應增強[10-13]。根系分泌物也會影響土壤微生物群落組成，Joner和Leyval[14]研究發現，植物根系分泌物可增加專性降解菌的數量，改變種群結構及促進共代謝作用。但總體而言由于根系分泌物組成成分復雜，目前相關研究主要集中在總根系分泌物對修復的影響方面，針對根系分泌物中具體成分在修復中的作用及其對土壤微生物群落的影響研究還較少。

前期研究發現能夠促進PAHs高效降解的植物其根系分泌物中大多含有大量的亞油酸，向污染土壤中添加富含亞油酸等物質的植物根系分泌物可以促進芘和苯并[a]芘等多環芳烴的降解[15]。目前為止，將亞油酸直接加入污染土壤中進行PAHs修復的研究相對很少，特別對其添加到土壤中后對土壤中細菌、真菌的群落結構及相關功能微生物的影響尚未看到報道。本研究采用向PAHs污染土壤中加入適量亞油酸鈉，通過HPLC分析PAHs殘余量，研究添加亞油酸鈉對PAHs污染土壤的修復作用。通過高通量測序分析修復過程中土壤微生物群落變化，探究亞油酸鈉修復PAHs污染土壤的機理，為其修復PAHs污染土壤的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤及材料

供試土壤采自南京郊區某鋼鐵企業附近表層土壤(0 ~ 20 cm)，風干后撿出植物根系、石礫等殘留物，過2 mm不銹鋼篩，充分混勻，待用。使用標準法[16]測定土壤的基本理化性質：pH(H2O)8.24，有機質41.84 g/kg，有效磷23.53 mg/kg，速效鉀72.66 mg/kg，陽離子交換量16.89 cmol/kg。供試亞油酸鈉購買于濟南鑫森源化工有限公司，工業級(>95%)。

1.2 試驗設計

試驗設置3個處理，3個重復，每個處理瓶裝供試土壤150 g。即：①對照(CK)；②施肥(F)；③施肥+亞油酸鈉(FSL)。試驗期間，土壤的含水量保持在大約60% 的田間持水量。施肥+亞油酸鈉處理中加入亞油酸鈉為1 000 mg/kg。無機營養素 (NH4)2SO4和K2HPO4被添加到施肥和施肥+亞油酸鈉處理中，使土壤中的初始N為250 mg/kg，P為100 mg/kg。60 d后，收集土壤，一部分土壤樣品在真空冷凍干燥器中凍干以測定15種PAHs(LMW-PAHs：萘(NAP)，苊(ACE)，芴(FLU)，菲(PHE)，蒽(ANT)；HMW-PAHs：熒蒽(FLUA)，芘(PYR)，苯并[a]蒽(BaA)，屈(CHR)，苯并[b]熒蒽(BbF)，苯并[k]熒蒽(BkF)，苯并[a]芘(BaP)，二苯并[a,h]蒽(DahA)，茚并[1,2,3-cd]芘(IcdP)和苯并[g,h,i]芘(BghiP))的含量。剩余部分存放在–25℃ 冰箱中用于土壤微生物分析。

1.3 PAHs分析

PAHs分析方法根據ISO 13877—1998標準進行。將約3.0 g冷凍干燥的土壤樣品(60目)與相同重量的無水硫酸鈉混合；然后將混合的樣品置于索氏提取管中，并在54 ℃ 水浴中用70 ml二氯甲烷萃取24 h；用旋轉蒸發器蒸發產物，將茄形瓶中的殘余物溶于2 ml環己烷中；將等份的0.5 ml環己烷溶液過含有1 g活性硅膠(200 ~ 325目)的內徑1 cm層析柱；用1︰1(/)正己烷︰二氯甲烷混合物進行洗脫；棄去最初的0.5 ml洗脫液，將洗脫液轉移到帶刻度的試管中并用氮吹到1 ml，加入乙腈(色譜純)定容為2 ml；再次用氮吹到1 ml，定容為2 ml；用0.22 μm有機過濾器過濾后置于棕色樣品瓶中。

使用配備有熒光檢測器(RF-10AXL)的Class-VP HPLC系統(Shimadzu，Kyoto，Japan)分析15種PAHs濃度，使用的柱是C18反相柱(VP-ODS 250 × 4.6 mm I.D.，粒徑5 μm)，在整個過程中柱溫保持在32 ℃。HPLC測定PAHs的詳細色譜條件，參閱Ni等[17]。

1.4 高通量測序

稱取土壤樣品0.5 g，利用土壤總DNA 提取試劑盒FastDNA? Spin Kit for Soil提取DNA樣品。使用引物515 F 5￠-GTGCCAGCMGCCGCGG-3￠和907 R 5￠-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3￠對細菌16S核糖體RNA基因的V4 ~ V5區進行PCR擴增；使用引物ITS1 F 5￠-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3￠和ITS2 R 5￠-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3￠擴增ITS2區域。具體的測序方案和引物設計由中國上海美吉生物醫藥科技有限公司提供。根據Hou等[9]的實驗程序和方法進行PCR擴增、擴增子提取和測序讀數優化和分析。對于每個樣品標準化12 502條細菌序列和51 434條真菌序列，使用具有97% 相似性截止值的UPARSE(版本7.1)對操作分類單元(OTU)進行聚類，并使用UCHIME去除嵌合序列。使用RDP分類器算法在70% 置信度閾值下對Silva (SSU123)16S rRNA和ITS rRNA數據庫進行分析。多樣性指數由MOTHUR計算，主要包括Shannon、Ace、Sobs 和Chao指數。通過主坐標分析(PCoA)利用Bray-Curtis距離矩陣分析處理間整體群落差異。使用LEfSe軟件檢測并找到豐度有顯著性差異的微生物類群，采用線性判別分析(LDA)來估算物種豐度對差異效果影響的大小。

1.5 統計分析

單向ANOVA分析處理之間的差異，并通過LSD測試在5% 保護水平下比較平均值。使用Excel、SPSS 21和Origin 9.1軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 PAHs去除

60 d后測定各處理土壤樣品中的PAHs殘余量。對照土壤(CK)中總PAHs的濃度為2 921 μg/kg。施肥處理F中的總PAHs雖然相較于CK處理降低了17.4%，但是無論總PAHs，還是2 ~ 3環的低分子量(low molecular weight，LMW)PAHs和4 ~ 6環的高分子量(high molecular weight，HMW)PAHs含量，與CK相比均沒有顯著差異。FSL處理中的總PAHs、LMW-PAHs和HMW-PAHs顯著低于CK處理，分別減少了40.6%、46.5% 和39.9%(圖1)。

(CK：對照，F：施肥，FSL：施肥+亞油酸鈉；誤差線表示標準偏差(n = 3)，根據Duncan的多范圍檢驗，圖中小寫字母不同表示處理間差異達P<0.05顯著水平；下圖同)

2.2 高通量測序

測序數據在序列優化后獲得共448 209條細菌和746 578條真菌序列。每個樣品細菌和真菌序列的平均數量分別為37 351條(12 502 ~ 106 068條)和62 215條序列(51 434 ~ 72 373條)。對97% 水平劃分的OTU在Bray-Curtis相似性度量上進行了主坐標分析(PCoA)，以揭示各處理間微生物群落的差異。如圖2所示，發現相同處理的樣品聚在一起，不同處理間的樣品在微生物群落結構上相互分異。細菌的PCoA圖顯示了CK、F和FSL處理的細菌微生物群落具有差異。真菌的PCoA圖中，第一軸將僅施肥處理F和FSL處理分開，第二軸將CK和FSL處理分開。微生物群落多樣性指數如表1所示，CK處理土壤細菌群落的Shannon、Sobs和Chao指數顯著高于F和FSL處理。真菌群落多樣性指數差異與細菌群落類似，而且真菌群落的F、FSL處理的Ace指數也顯著低于CK。

2.3 微生物分類學組成

對各處理微生物群落于80% 置信度水平進行分析，擴增的細菌序列分為40個門、101個綱，真菌序列分為7個門、24個綱。不同處理的總微生物組成相似，而每個門或綱的分布各不相同(圖3)，說明不同處理對不同微生物群落產生了不同程度的影響。

除了沒有鑒定到具體門類的序列，細菌群落組成分析顯示，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Firmicutes)是所有處理中的5個主要門，占整體序列的82.7% 以上(圖3A)。具體來說，FSL處理中放線菌門和厚壁菌門的相對豐度與CK和F處理相比有所提高。其中，FSL處理中放線菌門的豐度占群落組成的29.3%，而在CK和F處理中，放線菌門的豐度僅占18.5% 和19.5%。放線菌門是導致FSL處理組與CK和F處理組細菌群落組成差異的主要來源。將放線菌門的微生物進一步從屬水平分析發現，FSL處理中的(3.81%)、(3.39%)、(1.65%)和(0.48%)均顯著高于CK和F處理組(圖4A)。

關于真菌群落組成，除了沒有鑒定到具體綱的序列，糞殼菌綱(Sordariomycetes)、散囊菌綱(Eurotio-mycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)和接合菌綱(Zygomycota)是所有處理中的 4 個主要綱類，占整體序列的 83.5% 以上(圖3B)。其中FSL(68.3%)中糞殼菌綱的相對豐度高于CK(46.0%)和F(41.8%)。糞殼菌綱是導致 FSL 處理組與CK 和F 處理組真菌群落組成差異的主要來源。將糞殼菌綱的微生物進一步從屬水平分析發現，FSL處理中的(40.8%)和(2.89%)均顯著高于CK 和F 處理組(圖 4B)。接合菌綱在FSL 處理中相對豐度為 10.7%，而在CK 和F 中分別為 0.83%、3.15%。另外，屬水平分析發現接合菌綱的的相對豐度顯著高于 CK 和 F 處理組。

(每個處理3次重復，括號中的百分比表示每個排序軸的變化比例)

表1 不同處理的細菌和真菌基因序列的多樣性指數

注：Shannon為群落多樣性指數，Shannon指數越大，群落多樣性程度越高；Chao、Ace為群落豐富度指數，Chao、Ace指數越大，表示物種種類越多；Sobs為群落豐富度實際觀測值；表中數據為3次重復的平均值±標準差，根據Duncan的多范圍檢驗，同列數據小寫字母不同表示處理間差異達<0.05顯著水平。

(在所有處理中相對豐度<1%的細菌或真菌被歸類為“其他”，無法分類為任何已知組的序列被指定為“未分類”)

進一步對不同處理組群落組成運用基于 LDA 值的LEFSe 分析，其中由內至外輻射的圓圈表示由門至屬的分類級別。在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類，小圓圈的直徑大小與相對豐度大小呈正比。差異物種(biomarker)跟隨組進行著色，紅色節點表示在紅色組別(F)中起到重要作用的微生物類群，藍色節點表示在藍色組別(FSL)中起到重要作用的微生物類群，其他圈顏色意義類同。圖 5 顯示，和是FSL 處理中的細菌標記物，是 FSL 處理中的真菌標記物。將 FSL 處理 3 種差異物種的相對豐度與總 PAHs 含量作相關性分析，發現和的相對豐度與總 PAHs 含量呈負相關(圖 6)，但是的相對豐度與總PAHs 含量無相關性。

圖4 細菌(A)和真菌(B)群落在不同處理中相對豐度有所增加的屬

(根據該分類的排名最高的組，對判別分類的節點進行著色并對分支進行著色；如果分類單元在樣本組之間沒有顯著差異，則相應的節點為黃色；選定的高豐度分類群用字母表示)

3 討論

根系分泌物通過刺激其周圍微生物降解有機類污染物是修復PAHs污染土壤的主要途徑之一[18]。在本研究中，施肥(F)對LMW-PAHs和HMW-PAHs的去除均沒有顯著影響?？梢钥闯鎏砑覰、P等養分，雖然可為微生物提供營養，促進微生物的生長[9]，但是效果有限。因為N、P元素的添加能夠促進大多數的微生物增長，對PAHs降解微生物的特異選擇性不強，進而使得本研究中的污染物降解效果不顯著[19]。而添加亞油酸鈉(FSL)處理不僅提高了LMW-PAHs降解效率，同時也提高了HMW-PAHs的降解效率(圖1)。

為了進一步了解添加亞油酸鈉對污染土壤的修復機理，本研究通過高通量測序技術探究了試驗過程中微生物群落組成和變化，以深入了解在修復期間PAHs降解的生物過程?；贠TU組成的PCoA分析(圖2)顯示，FSL處理與CK和F之間的細菌和真菌群落明顯分異。此外，細菌和真菌的多樣性指數表明，FSL處理的Shannon、Sobs和Chao指數顯著低于CK處理(表1)。這個結果與我們之前的研究結果相似，即污染物的去除效率與細菌多樣性無關，而與富集的特定細菌群落相關[9]。添加亞油酸鈉刺激土著微生物的競爭與繁殖，其中包括有利于PAHs降解的微生物群，這種特異性選擇作用，對于生物修復的成功至關重要。

圖6 Streptocymes、Kribbella 和Humicola 的相對豐度與土壤中PAHs 含量的相關性分析

微生物降解是土壤中PAHs主要的降解方式[20]。已知超過50屬的細菌和真菌具有降解PAHs的能力[21-24]。有報道稱亞油酸鈉能夠促進革蘭氏陽性菌的增長[14]，在本研究中，相較于對照和施肥處理，添加亞油酸鈉處理組FSL中放線菌門中的、、和等革蘭氏陽性細菌顯著富集(圖3，圖4)。 LDA分析結果顯示，和是FSL處理中的細菌標記物(圖5)。有關放線菌群的研究顯示，和的細菌在PAHs污染場地富集，具有降解PAHs的能力[25-26]，在本研究中，的相對豐度與PAHs在土壤中的殘余量呈負相關(圖6)。未鑒別出具體屬別，前人研究發現屬于Intrasporangiaceae的、spp.、spp. 和等，均與PAHs的降解相關[27-28]。是土壤或者植物根際常見的細菌，其在堆肥及降解硝基苯酚試驗中被富集，但是其具體作用尚不明確[29-30]。本研究中，的相對豐度與PAHs在土壤中的殘余量呈負相關關系(圖6)，說明PAHs的降解可能與該菌相對豐度的增長有關。此外，變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門也是細菌群落的優勢菌門，這些門類都含有PAHs降解菌群[31-33]。

真菌一般通過不同的酶系統降解HMW- PAHs[34-35]。研究表明，子囊菌門是污染環境中的主要真菌，具有轉化或去除LMW- PAHs和HMW-PAHs的能力[36-37]。本研究中，Sordariomycetes菌綱(屬于子囊菌門)是所有處理組中的主要類別(圖3，圖4)。添加亞油酸鈉顯著提高了Sordariomycetes的相對豐度，Sordariomycetes是一組真菌類群，包括相對豐度變化顯著的和，這兩種菌屬均是已知的PAHs 降解菌[38-39]。添加亞油酸鈉處理的FSL處理中，接合菌綱的相對豐度也顯著增加，研究表明具有降解有機污染物如石油烴類的能力[40-41]。這些結果表明，添加亞油酸鈉顯著改變了微生物群落結構與組成以及與PAHs降解相關菌的生長，從而提高土壤中PAHs的降解效率。

4 結論

本研究通過微宇宙模擬試驗對外源添加根系分泌物刺激PAHs污染土壤的微生態機理進行了探究。通過HPLC對土壤中PAHs組分進行綜合分析，結果表明，添加亞油酸鈉對LMW-PAHs和HMW-PAHs的降解效率均有顯著提高。高通量測序數據分析顯示，這一降解效率的提高，與微生物群落多樣性無關，而與特定的微生物群落豐度變化相關。在添加亞油酸鈉處理中，PAHs降解相關功能菌、、、、、和的相對豐度顯著增加，其中，、和是亞油酸鈉處理土壤中的主要微生物標記物，且、和相對豐度與土壤中PAHs含量呈負相關。該研究結果揭示了亞油酸鈉強化土壤PAHs生物降解的微生態進程，同時指導我們在進行PAHs污染土壤修復研究中應多加關注PAHs降解相關微生物菌群。

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Mechanism of Sodium Linoleate Stimulating Microbial Remediation of PAHs Contaminated Soil

YUAN Jing1,2, WANG Qingling2, HOU Jinyu2, ZHANG Jie1, LIU Wuxing2*, LUO Yongming2

(1 College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu,Anhui 241002,China; 2 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

Root exudates play a key role in phytoremediation of PAHs contaminated soil, but the effects of separate root exudates on the removal of PAHs have not been studied. This experiment investigated the effects of sodium linoleate in root exudation on soil microbial community and PAHs degradation by soil microcosm culture experiment and high-throughput sequencing technology. After 60 days, the removal rates of PAHs was 40.6% for fertilizer + sodium linoleate, which were significantly higher than that of fertilization only (17.4%). Primary coordinate analysis (PCoA) indicated that the addition of sodium linoleate significantly altered soil microbial communities, and soil bacterial and fungal community compositions were significantly different from those of fertilization only. In addition, sodium linoleate amendment promoted the enrichment of PAH-degrading bacteria such as,,and, as well as the fungi,and. LEFSe analysis showed that,andwere the main microbial markers for the addition of sodium linoleate treatment, and the relative abundance ofandwas significantly negatively correlated with PAHs content in soil. The results of this study initially revealed the mechanism of sodium linoleate enhanced biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soils.

Polycyclic aromatic hydrocarbons; Root exudates; Sodium linoleate; Microbial communities

X53

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.05.011

袁靜, 王青玲, 侯金玉, 等. 亞油酸鈉刺激多環芳烴污染土壤微生物修復的機理研究. 土壤, 2020, 52(5): 948–955.

國家自然科學基金項目(U1662110，41671325)和江蘇省自然科學基金項目(BK20171521)資助。

袁靜(1991—)，女，安徽亳州人，碩士研究生，主要從事有機污染土壤生物修復研究。E-mail: 18356152798@163.com