烤煙粗脂肪提取工藝優化及光譜測定方法研究

楊正鋒,陳薪宇,崔一丹,楊金清,湯丹瑜,趙正雄,保志娟,*

(1.云南農業大學煙草學院,云南昆明 650201;2.云南中煙工業有限責任公司技術中心,云南昆明 650202;3.云南農業大學資源與環境學院,云南昆明650201)

脂質類化合物是生物體中的一類化合物,包括油脂和類脂。脂質類化合物通常采用石油醚進行提取,因為提取出的物質除了油脂、類脂、甾醇和萜類等高分子的脂質類,還包括一些低分子的揮發油、色素、醛等成分,因此也常稱為粗脂肪或石油醚提取物[1]。煙草的粗脂肪與煙草的香味和協調性密切相關,是衡量煙草香味的重要指標之一[2-4]?？緹熎贩N、部位、顏色、栽培技術及生態條件都會影響煙草粗脂肪的含量[5-9],因此研究煙草中粗脂肪的含量具有一定的意義。目前食品中粗脂肪測定多采用索氏提取法[10-12],煙草粗脂肪的行業標準方法YC/T 176-2003也是基于此原理[13]。該方法中所使用的器皿和樣品皆需要干燥,整個實驗時間要16 h以上才能完成[14],不適用于批量煙草樣品的快速分析測定。為了縮短實驗時間,一些研究者對該方法進行了改進。邵金良等將樣品提前浸泡過夜,并將稱量介質由索氏提取器的接受瓶改為濾紙筒,該方法顯著減少了設備、試劑用量和能耗,但整個實驗除去浸泡時間,仍然需要12 h[15]。也有研究者用超聲波輔助索氏提取粗脂肪[16-17],或是將索氏提取改為直接萃取,手動提取改為自動萃取儀提取[18-19],極大的減少了實驗時間。雖然粗脂肪的提取已經有了一些改進,但是經典的索氏提取法仍然需要進一步優化。

一般條件下,粗脂肪的測定是將索氏提取的殘留物烘干冷卻稱重。這個步驟雖然操作簡便,但也要耗時3～4 h。近年來,有研究者采用近紅外光譜法進行粗脂肪的快速測定[20-22],但該方法存在建模困難的問題,且對小規模樣品分析有一定的局限性[18]。紫外可見吸收光譜法具有操作簡單、快速和成本低的優點,已廣泛應用于各種成分的分析和油脂的鑒定[23-25]。煙葉的粗脂肪中包含甾醇、萜類和色素等化合物,故粗脂肪的石油醚溶液會吸收特定波長的光,可以考慮利用其產生的紫外-可見吸收光譜進行測定以提高效率。

響應面分析是一種解決多變量問題的統計方法,已經在各種提取工藝優化中得到了應用[26-29]?；陧憫娣治龊痛种镜奈展庾V,本研究采用索氏法提取粗脂肪,以稱樣量、回流時間、烘干時間為考察因素,研究了不同提取參數對粗脂肪含量的影響,通過Box-Behnken設計優化提取條件;并利用烤煙粗脂肪溶液在不同波長處的吸光度值與濃度成正比的關系,建立一種快速測量粗脂肪含量的光譜方法,以期為煙草粗脂肪的分析研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烘烤煙葉 來自云南玉溪的4種云煙87和2種K326(初次烘烤),剔除主脈剪碎于40 ℃烘箱內干燥2～3 h,用粉碎機粉碎,過40目篩,密封避光保存;石油醚(沸程30～60 ℃) 國產分析純。

UV-6100A紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;BS210S電子天平(感量0.1 mg) Sartorius公司;WGLL-230BE恒溫干燥箱(室溫～300 ℃) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烘烤煙葉粗脂肪的提取及含量計算 準確稱取一定質量的煙葉粉末樣品,分成兩份并用脫脂濾紙包好,放入105 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重后,將樣品放入索氏提取器中,加入200 mL石油醚,在(75±1) ℃水浴加熱回流提取一定時間后,回收石油醚,并將接收瓶外部洗凈于105 ℃烘箱內烘干1～3.5 h后,放置于干燥器中冷卻至恒重進行稱重。粗脂肪的含量計算公式:

式中:m2表示接受瓶加粗脂肪的質量,g;m1表示接受瓶質量,g;m樣表示煙樣取樣量,g;w表示樣品含水率,%。

1.2.2 煙葉粗脂肪提取條件的優化

1.2.2.1 單因素實驗 在回流6 h,105 ℃烘干2 h的條件下,考察稱樣量(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g)對煙葉粗脂肪含量的影響;在稱量樣為2.0 g,在105 ℃烘干2 h的條件下,考察回流時間(4、5、6、7、8、9 h)對煙葉粗脂肪含量的影響;在稱量樣為2.0 g,回流6 h的條件下,考察烘干時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h)對煙葉粗脂肪含量的影響。

1.2.2.2 響應面分析法優化工藝 在單因素實驗的基礎上,以上述3個因素為Box-Behnken試驗設計自變量,以粗脂肪含量為試驗設計的響應值,優化煙葉粗脂肪提取工藝條件。響應面設計實驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計的因素和水平

1.2.3 煙葉粗脂肪的光譜測定 在最優條件下提取煙葉粗脂肪,測定粗脂肪的質量(同時采用行業標準方法[13]進行質量確認)后,加入石油醚溶解并定容于50 mL干燥的容量瓶中,作為測定的母液,取部分母液用石油醚稀釋為不同的溶液;以石油醚作為空白,經紫外可見分光光度計掃描后得到各梯度溶液和母液的紫外吸收光譜。選擇最佳的工作波長,測定烤煙粗脂肪梯度溶液的吸光度,繪制標準曲線。同時,取1份云煙87和2份K326樣品按照優化的條件進行測定,考察光譜測定方法的適用性。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次,采用Microsoft Excel 2013、Design-Expert.V8.0.6和Origin 6.1軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 煙葉粗脂肪提取單因素實驗結果

2.1.1 稱樣量對粗脂肪提取的影響 固定其它條件,改變一個提取因素進行單因素實驗,每個條件平行3次,考察稱樣量對粗脂肪含量的影響。圖1所示,隨著稱樣量的增加,粗脂肪含量呈先升高后降低的趨勢,在3.0 g處達到最大值。但是樣品量大于3.5 g后,粗脂肪提取不完全,故測定的脂肪含量降低。因此實驗選定2.5、3.0、3.5 g煙樣重量為Box-Behnken實驗的三個水平。

圖1 稱樣量對粗脂肪提取的影響

2.1.2 回流時間對粗脂肪提取的影響 圖2是回流時間對粗脂肪提取的影響。從圖2中可以看出,回流時間為4～7 h時,粗脂肪的含量隨時間增加而增加,超過7 h后粗脂肪的含量變化較小,這表明7 h以后粗脂肪不再溶出?？紤]到回流時間過長,會抽提出更多的雜質,因此實驗以7 h作為Box-Behnken實驗的零水平。

圖2 回流時間對粗脂肪提取的影響

2.1.3 烘干時間對粗脂肪提取的影響 固定其它提取條件,考察了不同烘干時間對粗脂肪含量的影響。從圖3可以看出,烘干時間在1.0～3.0 h,隨著烘干時間的增加粗脂肪含量不斷下降,當烘干時間大于3 h后,粗脂肪的含量變化較小?？紤]到烘干時間不夠,會導致提取物未完全干燥,而烘干時間過久會造成提取物揮發損失,因此實驗參考前人研究[19]和行業標準[13],以2 h為干燥時間的0水平。

圖3 烘干時間對粗脂肪提取的影響

2.2 煙葉粗脂肪提取工藝優化

2.2.1 Box-Behnken試驗設計和優化結果 根據單因素實驗,采用Box-Behnken試驗設計,并利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行數據擬合,優化粗脂肪的提取工藝,實驗結果如表2所示。

表2 Box-Behnken設計粗脂肪試驗結果

2.2.2 回歸模型的建立與顯著性檢驗 利用軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合,獲得粗脂肪含量(Y)對自變量—稱樣量(A)、回流時間(B)、烘干時間(C)的二次多元回歸模型方程:Y=6.07-0.024A-0.096B-0.017C-0.023AB-0.020AC+0.14BC-0.059A2+0.031B2+(3.75×10-3)C2。

表3 回歸模型的方差分析

2.2.3 響應面圖分析 響應面圖是回歸方程的形象描述,能直接反應各因素與響應值的關系及各個因素間的交互作用。曲面坡度陡峭、等高線呈橢圓形表示兩因素交互影響大,而坡度平緩、等高線呈圓形則與之相反[30]。圖4直觀反映了稱樣量、回流時間、烘干時間兩兩交互作用對粗脂肪含量的影響。從圖4a中可以看出,回流時間(B)和稱樣量(A)的交互作用顯著性較弱,回流時間在高水平時,粗脂肪含量的響應面拋物曲線的最高點處于較低水平,隨著回流時間的下降,粗脂肪含量的響應拋物曲線最高點向高水平方向移動。稱樣量比較低時,粗脂肪含量的響應面拋物曲線的最高點處于較高水平。由圖4b可知,粗脂肪含量的響應面坡度比較平緩,表明稱樣量和烘干時間的交互作用較弱,且稱樣量的影響因素大于烘干時間。由圖4c可知,粗脂肪含量的響應面坡度比較陡峭,回流時間和烘干時間的交互作用顯著,且響應面的響應值在回流時間和烘干時間較短時較高,這與回歸分析結果相一致。

圖4 兩因素交互作用對粗脂肪含量影響的響應面圖

表4 煙葉粗脂肪傳統方法與本法測定結果比較

2.2.4 模型優化與驗證試驗 由Design-Expert. V8.0.6軟件回歸模型分析,得出的粗脂肪的最佳提取條件是:稱樣量3.08 g,回流時間6 h,烘干時間1.5 h,此時粗脂肪含量的預測值為6.355%。在此條件下做了五次驗證試驗,得粗脂肪含量品平均值為6.27%,與預測值的相對誤差為1.34%<5%,說明該模型較好地預測實際提取量。

分別取3種云煙87煙樣,用標準YC/T 176-2003的索氏提取法和本方法進行測定,結果如表4所示。從表中可以看出來,標準法和本法的測定結果之間沒有顯著性差異(F

2.3 煙葉粗脂肪光譜測定方法

2.3.1 煙葉粗脂肪的紫外可見吸收光譜 將濃度為2.763 g/L的粗脂肪母液用石油醚稀釋為0.276、0.55、1.105、1.658、2.211 g/L的溶液,分別掃描6個溶液在200～600 nm 波長范圍內的吸收光譜。在圖5中,在280～500 nm的波長范圍,各溶液的光譜顯示有5個明顯的吸收峰,最大吸收波長分別為298.5、326、415、435、475 nm。其中298.5 nm的吸收峰隨著溶液濃度的增加藍移至290 nm。

圖5 煙葉粗脂肪溶液的紫外可見光譜

2.3.2 工作波長的選擇及標準曲線 將濃度為2.763 g/L的粗脂肪溶液配制成系列濃度的工作液,分別測定290、298.5、326、415、435、475 nm處的吸光度,以粗脂肪濃度為橫坐標,溶液吸光度為縱坐標進行回歸分析,得到的回歸方程如表5所示。在一定的濃度范圍內,各波長下溶液的吸光度值與濃度線性關系良好,相關系數R2值在0.9938～0.9996。按公式LOD=3.3 σ/S,LOQ=10 σ/S求出各波長下的檢出限和定量限,其中σ指回歸工作曲線的殘余標準偏差,S指回歸方程的斜率。計算各波長的檢出限為0.074～0.238 g/L,定量限為0.223～0.721 g/L。隨著波長的增加,擬合曲線的相關系數增加,樣品的檢出限和定量限減小?？紤]到樣品濃度較低時,長波長下吸光度值測定的準確性,因此工作波長在326～475 nm較好。

表5 烤煙粗脂肪的標準曲線及檢出限

2.3.3 方法的重復性 重復性試驗取云煙87樣品,按1.2.3下進行處理,平行測定6次,求得各波長下吸光度的RSD分別為1.56%、1.77%、2.02%、2.73%、2.44%和2.94%,皆<3%(表6)。結果表明,本方法的重復性良好。

表6 粗脂肪溶液吸光度的重復性(n=6)

2.3.4 光譜方法的準確度試驗 選取了3個煙葉樣品,參照YC/T 176-2003方法提取粗脂肪,測定準確質量后,加入石油醚定容一定體積,用上述光譜試驗方法測定粗脂肪含量,每份樣品平行測定3次,結果見表7。從表中可以看出,不同波長測定樣品的相對誤差不同。其中,用326和415 nm波長處吸光度計算的3種樣品粗脂肪溶液濃度與實際濃度的相對誤差在-8.4%～7.7%之間,并且云煙87樣品的吻合度較好。而K326樣品因為含有的成分不同,用其它波長測量的相對誤差較大。因此,有多品種樣品同時測定時,采用326和415 nm波長處的吸光度定量較好;但若只有相同品種煙樣時,建議采用較長的波長,如475 nm等進行測定,方法的檢測限較低。

表7 不同樣品粗脂肪的測定結果

3 結論

利用響應面分析法對烤煙中粗脂肪的提取工藝進行了優化,最佳條件為:稱樣量3.08 g,回流時間6 h,烘干時間1.5 h,此時粗脂肪含量為6.27%。與傳統索氏提取方法相比,優化的方法縮短了測定時間,且方法的重復性和精密度較好,具有較好的可行性和實用價值。

利用烤煙粗脂肪溶液在290、298.5、326、415、435、475 nm波長處的吸光度值與濃度正比的關系,建立了一種快速測量粗脂肪含量的光譜方法。煙葉粗脂肪溶液的濃度在0.276～2.211或 0.276～2.763 g/L范圍內與吸光度有較好的線性關系。在多品種煙葉樣品測試中,選用326和415 nm波長來進行測定較佳。本方法與索氏法相比,粗脂肪不需要干燥,因此比較簡便和省時,且適合大批量煙葉粗脂肪的分析測定。另外,進一步研究后,本方法也有望發展成為煙葉粗脂肪的鑒定方法。