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鎘污染中性土壤伴礦景天修復的硫強化及其微生物效應①

2020-12-10 05:45吳廣美王青玲胡鵬杰楊鈺瑩張緒美沈文忠吳龍華駱永明
土壤 2020年5期
關鍵詞:景天硫磺群落

吳廣美,王青玲,胡鵬杰,楊鈺瑩,董 蓓,張緒美,沈文忠,吳龍華 *,駱永明

鎘污染中性土壤伴礦景天修復的硫強化及其微生物效應①

吳廣美1, 2,王青玲1,胡鵬杰1,楊鈺瑩1,董 蓓1,張緒美3,沈文忠3,吳龍華1 *,駱永明1

(1 中國科學院土壤環境與污染修復重點實驗室(南京土壤研究所),農田土壤污染防控與修復技術國家工程實驗室,南京 210008;2 中國科學院大學,北京 100049;3 太倉市農業技術推廣中心,江蘇太倉 215400)

采用田間微區試驗研究了施硫處理對中性鎘污染農田上伴礦景天鎘吸取修復效率、土壤pH、有效態鎘、有效態硫以及微生物群落變化的影響。結果發現:土壤pH隨時間和硫用量的增加而顯著下降,有效態鎘和有效態硫含量隨時間和硫用量的增加而顯著增加。在360 g/m2硫處理下,伴礦景天地上部鎘含量為70.9 mg/kg,較不施硫對照(38.3 mg/kg)增加85.1%,耕層土壤全量鎘去除率為19.4%,是對照(10.5%)的1.85倍。施硫處理150 d后,土壤和細菌相對豐度顯著高于試驗前土壤和對照處理。本試驗結果表明,中性土壤施加適量硫磺不僅可顯著提高污染土壤中鎘的生物有效性,也可通過調節與硫代謝相關的功能微生物,顯著增強鎘的植物吸取修復效率。

硫;鎘;伴礦景天;植物修復;微生物

在過去的幾十年中,由于工農業活動,我國耕地土壤鎘(Cd)含量不斷升高,甚至在工業落后的地區也出現鎘污染問題,這嚴重威脅著生態環境和農業生產功能,危害人體健康[1-2],鎘污染土壤的治理迫在眉睫。農田修復問題和技術面臨巨大挑戰,其中植物吸取修復技術具有原位、綠色、高效等優勢,且能最大限度地減少對土壤微生物群落和理化性質的干擾[3-4],適合修復大面積污染的農田土壤。伴礦景天()是在浙江某鉛鋅礦區發現的一種鎘超積累植物[5],對土壤鎘具有很強的吸收富集能力。伴礦景天對酸性土壤中鎘的去除效率顯著高于中堿性土壤[6],這與酸性土壤鎘有效性高有關。因此,如何增強中堿性土壤中鎘的生物有效性,是提高污染土壤中鎘的植物吸取修復效率的重要途徑。

強化植物修復技術包括化學、生物以及農藝等措施,其中化學強化修復是指向污染土壤中添加化學試劑、增加土壤重金屬移動性和有效性[7-8],但外加化學試劑所引起的二次污染風險以及對土壤理化性質的不利影響限制了其實際應用。近年來,硫元素在污染土壤重金屬形態轉化[9-11]以及植物體抵御重金屬毒害方面受到廣泛關注[12-15]。作為肥料,硫磺可補充作物硫營養,在好氧條件下被氧化成硫酸鹽,釋放H+,降低土壤pH,增加土壤鎘的生物有效性[16-17]。土壤微生物群落組成及活性高低是衡量土壤肥力大小和土壤質量高低的一個關鍵性指標,但土壤微生物群落的多樣性和結構對外界環境條件的變化較為靈敏,能反映環境變化和生態功能[18]。因此,本研究擬選擇典型鎘污染中性農田土壤,開展田間微區試驗,探討硫肥對鎘鋅超積累植物伴礦景天鎘吸取修復效率的影響,并探究硫肥的土壤微生物生態效應,為中性鎘污染農田的高效修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和植物

供試土壤為江蘇省東部某鎘污染農田土壤。將采集的0 ~ 15 cm表層土樣風干、過篩,部分用于育苗,部分用于基本理化性質(表1)的測定,測定方法參考《土壤農化分析》[19]。供試土壤為河流沖積母質發育的普通簡育水耕人為土,pH 6.85,為中性土壤[20],全鎘含量1.33 mg/kg,超出GB15618—2018篩選值[21]。供試植物為伴礦景天,采用種子育苗,于中國科學院南京土壤研究所植物生長室培養,待其長出4片真葉后選擇大小一致、長勢良好的幼苗移栽至田間。

表1 供試土壤的理化性質

1.2 田間試驗

田間試驗在上述鎘污染農田進行。試驗共設0、180、360、720 g/m2四個硫肥處理,每處理重復3次,隨機排列。每個微區3 m2(長2 m、寬1.5 m),小區間開40 cm寬、20 cm深的水溝。供試硫肥為分析純硫磺粉。土地翻耕平整后將硫肥均勻撒在土壤表面,然后多次翻耕使其與耕層土壤混勻。于2018年1月1日移栽伴礦景天幼苗,行、株距均為15 cm?;适┯玫租?5-15-15的復合肥600 kg/hm2,后期未追肥未灌溉,雜草通過人工撥除。試驗于2018年5月30日收獲。

1.3 樣品采集與測定

土壤樣品分別在伴礦景天種植后的0、40、90、150 d時采集,在150 d時同時采集1個周邊農田未施硫土壤(NS)。用不銹鋼土鉆在每個小區梅花形取5個0 ~ 15 cm耕層土壤,混合均勻,土樣運至實驗室,部分風干后過10目和100目尼龍篩,測定土壤理化性質及全鎘量;部分于-80℃冰箱保存,用于土壤微生物提取和高通量測序分析。土壤有效鎘采用pH 7的0.01 mol/L CaCl2按質量比為1∶10的土液比浸提,土壤有效硫采用0.008 mol/L Ca(H2PO4)2·H2O按質量比為1∶10土液比浸提[20]。土壤全量和有效態鎘含量采用石墨爐原子吸收分光光度計(Varian SpectrAA220Z)測定,土壤有效硫含量采用分光光度計(Metash Spectr UV-5800)測定。

伴礦景天地上部收獲后分別用自來水和去離子水洗凈,105 ℃殺青30 min,70 ℃烘干48 h,稱重,粉碎,HNO3-H2O2(體積比1∶1)消化,采用火焰原子吸收分光光度計(Varian SpectrAA220FS)測定地上部鎘含量。測定所用試劑均為優級純,并采用國家標準參比物質(芹菜:GBW10048)進行質量控制。參比物質測定結果均在合理范圍內。

1.4 土壤微生物測序

選用試驗90 d時的不施硫和施硫360 g/m2處理土壤,150 d時的農田周邊自然土壤(NS)、不施硫處理土壤和施硫360 g/m2處理土壤進行微生物測序。根據E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說明書進行總DNA抽提,DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測,利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量;用515F (5'-GTGCCAGC MGCCGCGG-3')和907R (5'-CCGTCAATTCMTTTR AGTTT-3')引物對V4可變區進行PCR擴增,擴增程序為:95 ℃預變性3 min,27個循環(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),最后72 ℃延伸10 min(PCR儀:ABI GeneAmp? 9700型)。擴增體系為20 μl,4 μl 5×FastPfu緩沖液,2 μl 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μl正反向引物(各5 μmol/L),0.4 μl FastPfu聚合酶,0.2 μl BSA(牛血清蛋白);10 ng DNA模板,ddH2O補足至20 μl。每個樣品3個重復,將同一樣品的PCR產物混合后用2% 瓊脂糖凝膠回收PCR產物,然后純化。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

原始測序序列使用Trimmomatic對序列進行質量控制,設置50 bp的窗口,如果窗口內的平均質量值低于20,從窗口前端位置截去后端所有序列,之后再去除質控后長度低于50 bp的序列。然后使用FLASH軟件進行拼接。拼接時overlap之間的最大錯配率為0.2,長度需大于10 bp,去除無法拼接的序列;根據序列首尾兩端的barcode和引物將序列拆分至每個樣本,得到有效數據。使用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),根據97% 的相似度對序列進行OTU聚類,并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進行物種分類注釋,比對Silva數據庫(SSU128),設置比對閾值為70%。通過計算各個處理中各菌屬門類所含序列占所在樣品總序列的比例,得到各菌屬水平的相對豐度,據此繪制類群的比例條形圖。用Mothur計算微生物群落的多樣性和豐度指數(Chao,Ace,InvSimpson指數,Shannon指數)和各個樣品微生物群落結構之間的比較。通過主坐標軸分析(PCoA),利用Bray-Curtis距離矩陣闡明樣品間整體群落的差異。

1.5 數據統計分析

本文所有數據為3次重復的平均值± 標準差,試驗所得數據采用Excel 2016和SPSS 19.0軟件進行分析,不同處理間差異性分析采用LSD法進行多重比較,顯著性水平為<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同硫處理對土壤pH、有效態鎘和硫的影響

從圖1A可以看出,在試驗進行的0 ~ 150 d,除對照處理(施硫0 g/m2)外,土壤pH均隨硫磺劑量和時間的增加不斷下降。在150 d時,與對照處理相比,180、360、720 g/m2硫磺處理的土壤pH分別降低了1.85、2.11和2.89個單位,硫磺處理土壤pH顯著低于對照(圖1A)。因此,中性土壤施用硫磺能夠顯著降低土壤pH,土壤pH的降低幅度與硫磺劑量和施加時間有關。本試驗最高劑量硫磺處理(720 g/m2)土壤pH可以在150 d內從6.85降低到3.69,最大降幅達到3.16個單位;在試驗進行的0 ~ 40 d,土壤pH范圍是6.40 ~ 6.85,下降幅度略小,這與相關研究前30 d內土壤pH明顯降低的結果不同[22],主要是因為本試驗的前30 d是冬春季節,野外溫度低,微生物活性低,所以硫磺氧化速度緩慢。在0 ~ 90 d所有硫磺處理土壤pH范圍是5.53 ~ 6.85,不會發生過酸的土壤環境而抑制伴礦景天生長[6]。

圖1 不同硫處理土壤性質的變化

與對照處理相比,施硫處理土壤有效鎘含量在0 ~ 90 d沒有顯著變化(圖1B),但在90 ~ 150 d時土壤有效鎘含量隨施硫時間和用量的增加而增加。在150 d時,施硫180、360、720 g/m2處理,土壤有效鎘含量分別達0.19、0.31、0.53 mg/kg,均顯著高于對照,而此時土壤pH范圍是3.69 ~ 4.73,顯著低于對照(6.58)。土壤有效鎘含量與土壤pH極顯著負相關,與其他研究結果一致[23]。土壤有效鎘含量在90 ~ 150 d時顯著提高,有利于伴礦景天地上部對鎘的吸收和積累。

硫磺在自然微生物的作用下被氧化產生硫酸根,增加土壤有效硫含量。從圖1C可以看出,有效硫含量隨著施硫時間和硫磺用量的增加而升高。在試驗40 d時,硫磺處理土壤有效硫含量和對照差異顯著。硫磺用量最高(720 g/m2)處理土壤有效硫含量在試驗40 d和150 d時分別達0.31 g/kg和0.74 g/kg,分別是對照的7.0倍和15.0倍。所有硫磺處理土壤有效硫含量在90 ~ 150 d均呈上升趨勢,且上升幅度大,表明硫磺氧化過程仍在進行且氧化速度快,這也與土壤pH在這一時段內下降幅度較大這一現象吻合。5月農田環境適宜的水分和溫度條件更適合微生物的生長繁殖,提高了硫磺氧化速度??梢?,隨著施硫量增加和植物種植時間的延長,土壤pH逐漸下降,有效鎘和有效硫含量則逐漸升高。

2.2 不同硫處理對伴礦景天生長和地上部鎘吸收的影響

伴礦景天在土壤pH 4.5 ~ 8.5的范圍內均能生長[6]。但當土壤pH過高時,土壤鎘生物有效性低,會降低伴礦景天修復效率,當土壤pH過低時,強酸性的土壤環境不利于伴礦景天的生長。表2數據顯示,各處理間伴礦景天地上部干物質量無顯著差異,但是過高的硫磺處理會略微降低伴礦景天地上部干重,從而影響伴礦景天的修復效率。在伴礦景天收獲時,360 g/m2硫磺處理土壤有效鎘含量為0.31 mg/kg,伴礦景天地上部干物質量為653 g/m2,地上部Cd含量最高,為70.9 mg/kg,是對照(38.3 mg/kg)的1.85倍,同時修復效率也最高(19.4%),是對照(10.5%)的1.85倍;而720 g/m2硫磺處理土壤有效鎘含量為0.53 mg/kg,伴礦景天地上部干物質量為530 g/m2,地上部Cd含量為51.4 mg/kg。這說明土壤中添加的硫磺劑量需要兼顧伴礦景天地上部生物量和土壤有效鎘含量這兩個因素,只有合適劑量的硫磺處理才能起到強化伴礦景天修復效率的作用,過高或者過低的硫磺劑量都會降低伴礦景天修復效率。

2.3 硫磺對土壤微生物群落的影響

2.3.1 微生物群落結構和多樣性分析 本研究只選用修復效率最高的硫磺處理(360 g/m2)、對照處理(0 g/m2)及自然背景土壤(NS)進行微生物群落分析比較。PCoA分析結果表明,添加硫磺處理與對照處理土壤微生物群落在試驗90 d時聚集在一起,但當試驗時間達到150 d時,硫磺處理與對照處理土壤微生物群落相互分異(圖2)。多樣性分析也有相似的結果,和對照及自然土壤(NS)相比,微生物群落的豐富度指數Chao和Ace及多樣性InvSimpson和Shannon指數,在硫磺處理90 d時無顯著變化;但硫磺處理150 d后,微生物豐富度和多樣性指數顯著下降(<0.05)(表3)。這些現象說明硫磺氧化時間越長對微生物群落結構及多樣性影響也越大,這可能是因為隨著硫磺氧化時間的延長,土壤微生物的生存條件變化越來越大,特別是土壤pH。由于大多數微生物生長最佳pH范圍很窄[24],并且不適合在強酸性環境生長。因此隨著施硫肥時間的延長,土壤pH逐漸下降時,不適宜環境的微生物會逐漸消亡,進而使得土壤微生物群落結構及多樣性發生改變。另外,由于土壤中的微生物對營養攝取及生長速率不盡相同,使得與硫代謝相關的微生物快速繁殖生長,而競爭能力差及無關的微生物逐漸被淘汰,這種選擇性的刺激作用是土壤微生物群落對環境的適應性表現。

表2 不同硫處理對伴礦景天生長和鎘吸收以及土壤鎘去除的影響

注:同列數據后不同小寫字母表示處理間差異達到<0.05 顯著水平,下表同。土壤Cd去除率= (×1) / (2×103),為伴礦景天地上部干物質量(g/m2);1為伴礦景天地上部鎘含量(mg/kg);2為每平方米耕層土壤Cd含量(239.4 mg),即鎘全量(1.33 mg/kg)×耕層厚度(15 cm)×容重(1.2 g/cm3)×面積(10000 cm2)。

圖2 各硫處理土壤中微生物群落在 97% 水平上的 OTUs 基于 Bray-Curtis 距離矩陣的PCoA分析

2.3.2 微生物群落組成及硫代謝細菌分析 硫磺是一種中性化學物質,它能以較低的成本有效地降低土壤pH[25]。土壤中硫磺的氧化反應主要是由包括硫桿菌在內的各種微生物介導的[26-28]。由圖3可以看出,150 d硫磺處理(360 g/m2)土壤中的變形菌門(Proteocbacteria)比較豐富(46%),同時在變形菌門下檢測到多種硫代謝相關的細菌(表4)。其中硫氧化菌屬(sp.)屬于嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌目(Acidiferrobacterales)。有研究表明該菌在生長過程中可以氧化單質硫和硫代硫酸鹽獲得電子,并且其最佳生長溫度范圍為42 ~ 45 ℃,但是最佳土壤pH為6.8 ~ 8.2[29]。因此,雖然硫磺處理為其提供了充足底物,但是150 d時的低pH可能抑制了該菌屬微生物的生長,從而導致硫磺處理土壤中sp.數目要低于無硫磺處理。另外,硫單胞菌屬(sp.)是可以將硫磺和硫代硫酸鹽氧化為硫酸以獲得電子進行化學無機營養生長的微生物,并且其要求土壤pH為2.7 ~ 6.8,溫度為35 ~ 50 ℃,但最佳土壤pH為4左右[30-31],這就使得該菌在150 d硫磺處理(360 g/m2)土壤中含量要顯著高于自然土壤(NS)和對照處理土壤,分別是兩者的1 107倍和107倍。這可能主要是因為硫磺處理土壤pH為4.47,為微生物提供了一個強酸性和底物充足的生長環境。同樣的原因導致可以氧化硫代硫酸鹽為硫酸并且在土壤pH為2的條件下也能生長的羅丹諾桿菌屬(sp.)[32-33]出現相同的變化趨勢,即其含量在150 d硫磺處理土壤中要顯著高于無硫磺處理,分別是自然土壤和對照處理土壤的153倍和44倍。這兩種菌通過自身代謝加速了硫肥的氧化,降低了土壤pH,提高了土壤中鎘的生物有效性,進而間接地促進了伴礦景天對鎘的吸收。同時,硫肥氧化過程為這兩種硫代謝菌提供了充足的底物和適宜的酸性條件,有利于菌的代謝和繁殖。以上結果說明,向土壤中添加硫磺不僅可以通過改變土壤理化性質,還可通過調節土壤中與硫代謝相關的功能微生物,提高土壤鎘生物有效性,從而強化植物吸取重金屬鎘。

表3 不同時間各硫處理微生物群落多樣性指數

圖3 各硫處理土壤中細菌門相對豐度的比較

表4 各硫處理硫氧化細菌差異(OUT,%)

注:nd表示未檢出。

3 結論

施硫可降低中性鎘污染土壤pH、增加鎘的生物有效性,進而提高伴礦景天的修復效率。本試驗最佳施硫量為360 g/m2,伴礦景天地上部鎘含量為70.9 mg/kg,耕層土壤全量鎘去除率為19.4%,是對照(10.5%)的1.85倍。硫磺處理為土壤微生物提供了強酸性和底物充足的生長環境,硫磺氧化后期(150 d),與硫代謝相關的功能細菌和含量顯著高于自然和對照土壤,表明適量硫磺添加是提高中性土壤鎘污染植物吸取修復效率的有效措施。

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Sulfur Assisted Cadmium Phytoextraction byand Its Effect on Microbial Community in Neutral Paddy Soil

WU Guangmei1, 2, WANG Qingling1, HU Pengjie1, YANG Yuying1, DONG Bei1, ZHANG Xumei3, SHEN Wenzhong3, WU Longhua1 *, LUO Yongming1

(1 Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, National Engineering Laboratory of Soil Pollution Control and Remediation Technologies, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3Taicang Agricultural Technology Extension Center, Taicang, Jiangsu 215400, China)

Afield plot experiments was conducted to investigate the effects of sulfur(S) application on cadmium(Cd) phytoextraction by, soil properties and microbial community in neutral paddy soil. The results showed that soil pH decreased while available Cd and available S increased with time and S dosages. The treatment of S at 360 g/m2obtained Cd concentration of 70.9 mg/kg in shoots, which was enhanced by 85.1% compared to the control group (38.3 mg/kg). The removal rate of total Cd from surface soil was 19.4%, which was 1.85 times as high as that of the control group (10.5%). The relative abundance ofandin soil treated with 360 g/m2S at 150 day were significantly higher than those of natural and control groups. This study shows that adding appropriate amount of S to neutral soil can not only significantly improve Cd bioavailability in soil, but also enhance the efficiencies of phytoremediation by regulating the functional microorganisms related to S metabolism.

Sulfur; Cadmium;; Phytoremediation; Microorganisms

S19

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.05.007

吳廣美, 王青玲, 胡鵬杰, 等. 鎘污染中性土壤伴礦景天修復的硫強化及其微生物效應. 土壤, 2020, 52(5): 920–926.

國家重點研發計劃項目(2016YFD0801104)、江蘇省科技計劃項目(BE2017778)、蘇州市產業技術創新專項農業科技創新項目(SNG2017076)和太倉市重點研發計劃項目(TC2018SF06)資助。

吳廣美(1993—),女,山東臨沂人,碩士研究生,主要從事土壤污染與修復研究。E-mail: wgmnkymm@163.com

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