高通量測序分析黑土稀有微生物群落結構

關健飛 曹陽

摘要：稀有微生物群落作為地球生態系統中的重要組成部分，在土壤生態系統中扮演著超比例的角色。以黑龍江省黑土中稀有微生物為研究對象，采用高通量測序技術分析黑土中稀有細菌、真菌群落結構組成及其與土壤理化性質的相關性。對屬水平上稀有微生物群落進行分析發現，相對豐度在0.01%以下的稀有細菌菌屬420種，稀有真菌菌屬210種，各采樣點處稀有微生物類群分布差異性較大，存在特征稀有微生物類群，但未見黑土共有稀有菌屬的檢出?？偭缀陀行Я椎暮糠謩e影響不同種類的稀有細菌菌屬，其中放線孢菌屬（Actinomycetospora）與總磷含量呈現極顯著正相關關系，無色桿菌屬（Achromobacter）與有效磷含量呈現極顯著正相關關系。真菌稀有菌群中的小孢霉屬（Microbotryum）、頂孢霉屬（Acremonium）等與土壤含水率、有機質含量、總氮含量、硝態氮含量呈現極顯著正相關關系。

關鍵詞：稀有微生物;群落結構;高通量測序;黑土;理化性質

中圖分類號： S154.3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0288-05

微生物作為土壤生態系統的重要組成部分，在維持生態系統功能和服務過程中起著關鍵作用[1]?，F階段對于土壤微生物的研究主要集中在物種組成、結構功能以及遺傳多樣性等方面。土壤中的微生物群落具有典型的物種豐度分布偏斜特征，表現為相對高豐度的少量優勢物種與相對低豐度的大量稀有物種共存[2]，稀有群落作為地球生態系統中至關重要的組成部分，在土壤生態系統中扮演著超比例的角色[3]，是微生物群落功能的一個潛在驅動力[4]，稀有微生物群落是評價微生物多樣性的重要因素，是微生物遺傳和功能多樣性的存儲庫，具有驅動地球化學循環[5-6]、指示環境變化[7-8]、降解污染物[9-10]、穩定群落結構[11]等重要功能。然而相對于優勢類群，現階段對于稀有微生物類群的研究較少[12]。本研究以黑龍江省黑土為研究對象，解析土壤中稀有細菌和真菌的群落結構組成，分析稀有微生物群落與土壤理化性質的相關性，為稀有微生物的生態學研究奠定基礎。1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

本研究以黑龍江省表層（0～20 cm）黑土為研究對象，在黑龍江省區域內設置10個采樣點（圖1），于2019年5月進行土壤樣品采集。土壤樣品采集過程中去除細根等雜物后，充分混勻，置于密封袋，帶回實驗室后，-80 ℃保存土壤樣品用于高通量測試分析，常溫風干土壤樣品用于理化性質測定。

1.2 高通量測序

采用Illumina MiSeq測序平臺對測序樣本進行雙端測序，委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。測序過程中，采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤總DNA。采用細菌16S rRNA基因V3-V4區引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對高變區片段進行擴增，PCR反應條件為95 ℃預變性3 min;27次循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s）;72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。20 μL反應體系為4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL的Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL的Reverse Primer（5 μmol/L），0.4 μL的FastPfu Polymerase，0.2 μL的BSA，10 ng的Template DNA，補ddH2O至20 μL。真菌18S rDNA的V5-V7區引物SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）對高變區片段進行擴增，PCR反應條件為90 ℃預變性3 min;37次循環（95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s）;72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。20 μL反應體系為 4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL的Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL 的Reverse Primer（5 μmol/L），0.4 μL的FastPfu Polymerase，0.2 μL的BSA，10 ng的Template DNA，補ddH2O至20 μL。利用QuantiFluorTM-ST微型熒光計進行PCR產物檢測定量。測序數據經過barcode拆分后獲得的有效序列信息統計，使用Qiime2軟件中的DADA2插件對所有樣品的全部原始序列進行質量控制、去噪、拼接并且去嵌合體，形成OTU。

1.3 土壤理化性質測定

土壤含水率的測定采用真空烘箱法;pH值的測定采用電位法;有機質含量的測定采用重鉻酸鉀滴定法;全氮含量的測定采用半微量開氏法;全磷含量的測定采用氫氧化鈉堿融-鉬銻抗比色法;全鉀含量的測定則采用火焰光度法;硝態氮含量采用連續流動分析儀法進行測定;有效磷含量采用鉬銻抗比色法進行測定，其中酸性土壤使用氟化銨-鹽酸作為浸提劑，堿性土壤使用碳酸氫鈉作為浸提劑;速效鉀含量則使用乙酸銨浸提-火焰光度計測定，每個土壤樣品測3次取平均值記錄，用于后續試驗數據的分析。

1.4 數據處理方法

選取代表性OTU序列，與核糖體RNA數據庫（Greengenes Database 13_8版本[按99%序列相似性聚類]）進行比對獲得物種注釋信息。使用Excel 2010、Origin 8.0對數據進行處理以及作圖分析，使用SPSS 19.0進行土壤理化性質和稀有細菌、真菌菌群的Pearson相關性分析以及各采樣點的細菌、真菌聚類分析，本研究中細菌和真菌菌屬稀有性的定義為小于0.01%的相對豐度[13]。

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