細菌脲酶蛋白結構與催化機制

賀越 趙圣國 張曉音，2 鄭楠 王加啟

（1. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 動物營養學國家重點實驗室，北京 100193；2. 華中農業大學動物科學技術學院，武漢 430070）

脲酶（Urease，EC 3.5.1.5）是一種活性中心含有鎳離子的金屬酶［1］，由許多植物、真菌、細菌和一些無脊椎動物合成［2］。脲酶催化尿素分解產生氨和氨基甲酸酯，后者進一步自發地分解產生氨和碳酸氫鹽［3］。動物、植物和微生物能利用脲酶催化產生的氨作為養分，促進自身的代謝生長［4］。例如，在反芻動物生產中，瘤胃微生物利用氨合成微生物蛋白，供給機體利用，同時幫助降低蛋白質飼料成本［5］。但是，脲酶也存在諸多不利的影響。反芻動物瘤胃中的微生物脲酶活性過高會使體內產氨速度大于氨的利用速度，極易引起氨中毒［6-7］。人體內一些致病菌能利用分泌的脲酶對機體產生毒害作用，如人胃中的幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）脲酶分解尿素產生氨，致使胃中pH升高，促進幽門螺桿菌的生長繁殖，進而引發與胃腸相關的癌癥［8］。由此可見，脲酶所具備的獨特生物學功能，對動物養殖、人類健康等方面都具有深遠的影響。

不同細菌的脲酶基因簇在組成成分上存在一定的差異，但大部分都由結構基因和輔助基因組成，少部分還包含調節基因。由脲酶基因簇編碼的脲酶蛋白也分成結構蛋白和輔助蛋白。細菌脲酶結構蛋白包含活性中心，而沒有金屬離子與活性中心作用的脲酶結構蛋白處于失活的狀態，只有當輔助蛋白協助將金屬鎳傳遞到活性中心后，脲酶結構蛋白才被激活，從而起到催化尿素分解的作用［9-10］。催化活性依賴鎳離子是脲酶的一個獨特特征［11］，也是脲酶抑制劑開發的一個靶點。因此，本文將從細菌脲酶結構特征、活性中心特征、脲酶催化機制、脲酶抑制劑作用機制4個方面進行綜述，以期為脲酶的研究提供參考。

1 脲酶結構蛋白的結構特征

目前蛋白質數據庫（Protein Date Bank，PDB）中收錄的脲酶結構蛋白晶體結構的總數量為97，而大部分為細菌脲酶，其中產氣克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）脲酶、芽孢桿菌（Sporosarcina pasteurii）脲酶、幽門螺桿菌脲酶分別占總數的35%（34）、23.7%（23）、18.5%（18），在這些晶體結構中包括一些突變的脲酶結構和抑制劑作用下的晶體結構。產氣克雷伯氏菌脲酶、巴氏芽孢桿菌（Bacillus pasteurii）脲酶和幽門螺桿菌脲酶是目前研究得較為透徹的3種細菌脲酶。

不同來源的細菌脲酶結構蛋白的亞基數量存在差異，但亞基組成上也存在聯系（圖1）［12-13］。產氣克雷伯氏菌脲酶和巴氏芽孢桿菌脲酶由UreA（γ）、UreB（β）、UreC（α）3個亞基組成，而幽門螺桿菌脲酶則由兩個亞基UreA（β）、UreB（α）組成，研究發現幽門螺桿菌脲酶中β亞基和產氣克雷伯氏菌脲酶、巴氏芽孢桿菌脲酶中β和γ亞基融合體具有同源性，三者的α亞基具有同源性［14］。盡管脲酶結構蛋白的四級結構存在差異，但是一般都會形成相似的三聚體結構［15］。圖2是產氣克雷伯氏菌脲酶、巴氏芽孢桿菌脲酶和幽門螺桿菌脲酶的連續剖面圖［16］，產氣克雷伯氏菌脲酶和巴氏芽孢桿菌脲酶由α、β、γ三個亞基聚合形成（αβγ）3形式［13，17］，幽門螺桿菌脲酶由α、β二個亞基以［（αβ）3］4形式聚合形成。脲酶結構蛋白的α亞基包括1個TIM（Triosephosphate isomerase，異丙酮酸異構酶）桶狀結構和1個β-折疊域；β亞基位于這個三聚物的外表面，以β-折疊為主；γ亞基則既包括α-螺旋也包括β-折疊［18］。幽門螺桿菌脲酶的β亞基有N端和C端域，兩個結構域之間由1個短的loop環相連接，位于α亞基的上面和側面，起著連接3個子單位的作用，3個β亞基的N端以首尾相連的方式連接，從而促使三聚形式的形成［14］。在產氣克雷伯氏菌脲酶中，每一個α亞基與2個β和γ亞基相連形成“三角形”的邊，并且位于β和γ亞基的中間；每一個β亞基與2個毗鄰的α亞基連接，位于“三角形”的角上；每一個γ亞基也與2個α亞基相連，并且與另外2個γ亞基緊密連接［19］。

脲酶結構蛋白亞基的功能目前也有一些研究。通過化學交聯質譜的方法對產氣克雷伯氏菌脲酶進行研究發現，β亞基上的賴氨酸76（Lys76）與α亞基的賴氨酸382（Lys382）能發生交聯，而這兩個氨基酸在晶體結構中的位置相距較遠，這提示了β亞基可能在與傳遞鎳離子的輔助蛋白相互作用下發生了構象變化，從而使二氧化碳（CO2）和鎳離子能更好地進入活性中心［20-21］。通過對產氣克雷伯氏菌脲酶的β亞基中的第19個氨基酸進行突變，揭示了β亞基能避免金屬離子在進入活性中心前被鰲合，并促進金屬離子進入活性中心［22］。

圖1 細菌脲酶結構蛋白亞基組成與排布［12-13］

2 脲酶結構蛋白的活性中心及flap區域

2.1 脲酶結構蛋白的活性中心

脲酶活性中心位于結構蛋白中，在催化尿素分解的過程中發揮著重要作用。研究發現，不同來源的細菌脲酶活性中心結構具有很高的相似性，如產氣克雷伯氏菌脲酶和芽孢桿菌脲酶［23］。這也提示對不同來源的細菌脲酶結構蛋白活性中心進行比較分析，對開發廣譜性微生物脲酶抑制劑化合物有著重要的意義。已知的脲酶的活性中心由高度保守的氨基酸序列［24］、2個金屬離子、金屬離子配位體組成［25］。金屬離子是脲酶的激活劑，只有當金屬離子進入活性中心后，脲酶結構蛋白才能被激活。激活脲酶的最有效的金屬離子是鎳離子，曾有研究用其他金屬離子來替代鎳離子，發現其他金屬離子激活脲酶的效果甚微［26］。脲酶結構蛋白每一個αβγ或每一個αβ亞單位（圖2）中含有一個活性中心，活性中心位于α亞基上，每一個活性中心包含2個鎳離子（紅色球體）。由此可知，一個產氣克雷伯氏菌脲酶或巴氏芽孢桿菌脲酶有3個活性中心，包含6個鎳離子，一個幽門螺桿菌脲酶有12個活性中心，包含24個鎳離子［27］。

圖2 巴氏芽孢桿菌（A）、產氣克雷伯氏菌（B）、幽門螺桿菌（C）的脲酶結構蛋白的結構特征［16］

脲酶結構蛋白的活性中心的這兩個鎳離子稱為Ni1和Ni2，兩個鎳離子由1個氨基?；馁嚢彼幔↙ys）殘基和1個羥基連接，2個鎳離子之間的距離約為3.7 ?，通過突變研究發現，氨基?；腖ys殘基是脲酶活化過程中必不可少的［28-30］，除此之外，Ni1還與另外2個組氨酸（His）殘基和1個水分子配位，而Ni2除了與2個His殘基和1個水分子配位外，還有一個天冬氨酸（Asp）與之配位［31-32］（圖3），連接2個鎳離子的羥基與3個水分子（2個與鎳離子配位）一起在活性中心形成了1個四面體［33］。

通過定點突變的方法，用丙氨酸（Ala）對產氣克雷伯氏菌脲酶活性中心的His、Asp進行替換，結果發現當活性中心αHis134、αHis136、αHis246等與鎳離子相結合的氨基酸以及鎳離子周圍的αHis219、αAsp221等氨基酸發生突變后，脲酶的活性顯著降低，這一結果的原因可能是與鎳離子配位的氨基酸發生突變后使鎳離子與活性中心的配位發生改變，進一步改變了脲酶活性，而αHis219本身與促進底物與鎳離子的結合有關［34-35］，發生突變后，致使底物與鎳離子的結合能力降低，從而反映出脲酶活性的降低。

2.2 flap區域

在脲酶催化過程中，除活性中心氨基酸殘基發揮作用外，活性中心附近的半胱氨酸（Cys）形成了一個柔性、可移動的flap區域（圖4）［16］。這個flap區域覆蓋在活性中心上，由螺旋-轉角-螺旋結構域組成，通過運動控制一個His殘基來調控底物的進入和產物的排出［18，36］。在催化過程中，flap區域的氨基酸殘基主要通過氫鍵與底物結合，從而起到穩定催化過渡狀態、加速催化反應的作用［37］。用Ala對產氣克雷伯氏菌脲酶flap區域的Cys319進行替換，脲酶活性顯著下降，驗證了Cys319 在脲酶催化中起著重要的作用［38］。

圖3 產氣克雷伯氏菌脲酶活性中心［12］

圖4 脲酶flap區域開放（A）和關閉（B）［16］

3 脲酶的催化機制

脲酶催化尿素分解的機制一直以來都頗受爭議［39-40］，隨著脲酶抑制劑的研究的深入，有一種催化機制獲得了廣泛的認可［41-42］。該機制［43］是：脲酶被鎳離子激活后，其flap區域打開，允許底物尿素進入活性中心，然后尿素取代活性位點的3個水分子（圖5-A），即尿素的羰基氧與Ni1離子結合，這種結合使尿素的碳更親電，因此更容易發生親核攻擊（圖5-B），當尿素與Ni1結合后，flap區域關閉，即整個催化過程與外界隔離。然后，尿素氨基氮原子與Ni2結合，這就使得尿素與脲酶形成雙齒配位（圖5-C），這種結合有助于連接兩個鎳離子的水分子親核攻擊尿素的羰基碳，使尿素中的O=C雙鍵發生斷裂（圖5-D），親核攻擊促使NH3和氨基甲酸酯的形成，而后flap區域打開，將催化產物釋放出來（圖5-E），flap區域的打開讓下一個尿素分子進入活性中心，從而進行下一個催化反應［44］。但是目前這種催化機制也尚存在一點爭議，主要爭議點是，Benini等［40］提出的這個機制中認為親核攻擊是通過連接兩個鎳離子的氫氧根來為NH3提供質子的，但Karplus等［39］認為是flap區域的一個His殘基起到質子化作用。另外，Karplus等［39］還考慮了一種催化機制，即尿素與Ni1和Ni2單齒結合，而兩個鎳離子提供的水分子親核攻擊尿素羰基碳。

4 脲酶抑制劑作用機制

脲酶抑制劑可以對脲酶的活性進行調控［45-46］。目前已知的脲酶抑制劑種類繁多，根據脲酶與抑制劑的結構特征可大致分為兩類：（1）與脲酶活性中心鎳離子相互作用的脲酶抑制劑，如尿素類似物［47］、氧肟酸類［48］、磷酸二酰胺及其衍生物［49］等；（2）與flap區域保守的氨基酸相互作用的脲酶抑制劑，如1，4-苯醌［50］、鄰苯二酚［51］、一些重金屬離子［52］等。盡管存在多種脲酶抑制劑，但是目前只有乙酰氧肟酸可用于治療幽門螺桿菌引起的胃和尿道感染疾病，它也是目前市場上唯一的商用抑制劑。

脲酶抑制劑與脲酶活性中心相互作用的機制分成兩種，一種是以硫脲為代表的尿素類似物，這類小分子的結構往往大于尿素分子，其結構中含有尿素結構部分，這就使得尿素類似物能像尿素一樣與脲酶結合，其結合機制和尿素結合到脲酶的過程一樣，區別在于脲酶不能分解尿素類似物［53］。另一種是磷酸二酰胺及其衍生物類脲酶抑制劑，這類小分子的結構與底物沒有相似性，它本身不與脲酶活性中心結合，而是通過分解成其他中間產物來發揮作用，也稱為“機械性抑制劑”。Mazzei等［54］通過X-射線晶體衍射技術（X-ray）獲得了在正丁基硫代磷酰三胺（N-（n-butyl）thiophosphoric triamide，NBPT）作用下的SPU晶體結構，其分辨率達到了1.28 ?，并從結構角度揭示了NBPT能夠與脲酶活性位點中的鎳離子相互作用，進行原位水解，生成一個四面體結構的分子（MATP）阻斷活性位點（圖6）。Benini等［40］也通過X-ray獲得了苯基磷二酰胺（Phenylphosphorodiamidate，PPD）與巴氏芽孢桿菌脲酶相互作用的晶體結構，他們發現，在PPD作用下，巴氏芽孢桿菌脲酶活性中心與鎳離子相互作用的氨基酸殘基位置和天然狀態下沒有顯著差異，根據結構顯示，實際與活性中心發生結合的不是PPD，而是其一種產物DAP，它是一個四面體分子。電子密度揭示了這個四面體形狀的分子精確地取代了天然巴氏芽孢桿菌脲酶中的4個水/氫氧根分子簇，通過3個原子與活性中心結合：一個對稱地橋接兩個鎳離子，而另兩個分別與一個鎳離子結合。

1，4-苯醌、鄰苯二酚及一些重金屬離子及其衍生物對脲酶的抑制作用機制是金屬離子作用在活性中心周圍的flap區域。有研究對1，4-苯醌抑制作用下的芽孢桿菌脲酶的晶體結構進行分析，得到了分辨率為2.07 ? 的脲酶晶體結構，發現1，4-苯醌共價結合脲酶flap區域的Cys322，阻礙flap區域的活動，從而起到抑制脲酶活性的作用［50］，而鄰苯二酚的抑制機制與1，4-苯醌相類似［51］。Mazzei等［55］獲得了分辨率為2.14 ? 的金離子（Au3+）抑制芽孢桿菌脲酶的晶體結構，發現兩個Au3+與flap區域的Cys322、His323、Met367三個氨基酸殘基結合，兩個Au3+由Cys322連接起來，其中一個Au3+與His323結合，另一個Au3+與Met367結合，Cys322、His323能調節調節活性中心空腔大小和催化相關的關鍵氨基酸殘基的位置，而Met367位于面對flap區域的一個loop環上，Au3+與這3個氨基酸殘基的結合阻礙了flap區域的活動，從而抑制了脲酶的催化活性，晶體結構分析也發現Au3+的存在對金屬離子所在的活性中心沒有顯著影響（圖7），而銀（Ag）的衍生物對芽孢桿菌脲酶的抑制機制同Au3+類似［56］。

圖5 脲酶的催化機理［43］

5 總結

目前運用晶體結構學的手段已經獲得了多種來源的細菌脲酶結構蛋白的晶體結構。雖然不同來源的脲酶結構蛋白的組成上存在差異，但是發生催化反應的活性中心及周圍的flap區域卻極為相似，底物與活性中心的鎳離子相互作用后被分解，而脲酶抑制劑可以通過與鎳離子或者flap區域相互作用來達到抑制脲酶活性的效果。雖然目前對于脲酶的研究已經很多，但仍需要對以下幾個方面的問題進行探索。

一是組成脲酶結構蛋白的各個亞基的結構及功能的研究。目前很少有對不包含活性中心的各個亞基的結構的研究。另外，各個亞基彼此之間是通過什么樣的結合方式相互作用，而這種相互作用對于金屬離子傳遞進入活性中心的意義是什么都需要深入研究。

圖6 MATP結合SPU活性位點的原子模型［54］

圖7 Au3+與芽孢桿菌脲酶相互作用［55］

二是對更多來源的細菌脲酶進行研究。本實驗室長期對奶牛瘤胃微生物進行研究發現，瘤胃微生物種類繁多，微生物脲酶蛋白來源具有多樣性，有哪些微生物能產生脲酶呢，而這些脲酶基因是如何表達的，瘤胃微生物脲酶的結構同已知的脲酶結構上是否存在差異等問題還未解決。對不同來源的微生物脲酶進行定向的研究，更有利于對脲酶的活性進行有效的調控。

三是基于脲酶晶體結構開發新型脲酶抑制劑。脲酶研究的最終目的是有效地調控它的活性，脲酶抑制劑的開發依賴于脲酶結構的解析。目前所得的脲酶結構幾乎都是通過X-射線晶體衍射技術得到的，運用冷凍電鏡技術解析脲酶的結構是否會有不同的發現呢，而新開發的脲酶抑制劑如何進行有效的生理評價等問題尚待研究。