雌性大鼠手術去勢骨質疏松癥模型建立及評價

陳沙 王桂云 李榮慧 向振 吳結枝 卓海燕 劉平安 張國民

〔摘要〕 目的 從動情周期、骨密度、骨組織形態結構和原代骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）生長曲線4個層次判定雌性大鼠手術去勢造模是否成功。方法 30只2月齡SPF級雌性大鼠，隨機平均分為空白組、假手術組和模型組3組。手術去勢造模完成后次日起連續7 d對3組大鼠進行陰道脫落細胞涂片，判斷動情周期。造模后第8天取左側股骨組織做骨密度測定和HE染色，取右側骨組織分離原代BMMSCs。結果 空白組和假手術組動情周期正常，模型組大鼠動情周期紊亂;骨組織HE染色顯示模型組骨小梁稀少且間距加大;與空白組比較，假手術組骨密度和BMMSCs生長速率差異無統計學意義（P>0.05），與假手術組相比，模型組骨密度顯著降低，BMMSCs生長速率顯著下降，差異具有統計學意義（P<0.01）。結論 造模成功后的雌性大鼠動情周期紊亂，骨密度降低，骨小梁疏松，BMMSCs的生長緩慢，為骨質疏松癥動物模型建立判定提供較全面的依據。

〔關鍵詞〕 去勢雌性大鼠;骨質疏松癥;動物模型;動情周期;骨密度;骨髓間充質干細胞

〔中圖分類號〕R-332 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.11.003

〔Abstract〕 Objective To determine the success of female rats' surgical castration model from four levels of estrus cycle， bone density， bone tissue morphology and primary bone marrow mesenchymal stem cells （BMMSCs） growth curve. Methods Thirty two-month-old SPF female rats were randomly and equally divided into 3 groups： a blank group， a sham operation group and a model group. The vaginal exfoliated cell smears were performed on the 3 groups of rats for 7 consecutive days after the completion of the surgical castration model to determine the estrus cycle. On the 8th day after modeling， the left femur tissue was taken for bone density determination and HE staining， and the right bone tissue was separated from primary BMMSCs. Results The estrous cycle of the blank group and the sham operation group was normal， and the estrus cycle of the model group was disordered. The HE staining of bone tissue showed that the bone trabecula of the model group was sparse and the spacing increased; Compared with the blank group， the differences in bone density and BMMSCs growth rate of the sham operation group had no statistical significance （P>0.05）. Compared with the sham operation group， the bone density of the model group was significantly reduced， and the growth rate of BMMSCs was significantly reduced. The difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion After successful modeling， female rats have estrous cycle disorder， decreased bone density， bone trabecula porosity， and slow growth of BMMSCs， which provide a more comprehensive basis for the establishment of osteoporosis animal models.

〔Keywords〕 ovariectomized female rat; osteoporosis; animal model; estrous cycle; bone density; bone marrow mesenchymal stem cells

根據國家統計局調查顯示[1]，我國65歲以上人口接近1.4億（約占總人口的10.1%），是世界上老年人口絕對數最多的國家。有專家預測[2]，2050年我國用于治療原發性骨質疏松癥性骨折費用將達1 630億元。隨著人口老齡化趨勢的日益加重，骨質疏松癥將成為我國重要的公共健康問題，因此，開展骨質疏松癥研究具有較高的科學價值。目前，骨質疏松癥的發病機制尚不明確，在針對骨質疏松癥發生機制開展的各種研究方法中，動物模型是目前較為常用的一種研究方法。造模方法中的手術去勢是指通過去除雌性大鼠雙側卵巢的方法造成雌激素水平急劇下降、骨量大量丟失，建立骨質疏松癥模型，具有建模因素單一、建模成功率高、可重復性好、可信度高和能夠很好地體現雌激素水平下降這一重要病理生理現象等優點[3]。本實驗采用雌性大鼠作為研究動物[4]，通過陰道脫落細胞涂片、股骨密度測定、骨組織形態和原代骨髓間充質干細胞（bone

marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）生長曲線4個層次的客觀指標來判定造模是否成功[5]。

1 材料

1.1 ?動物

SPF級SD雌性大鼠，許可證號：SCXK（湘）2016-0002，體質量190～250 g，6～8周齡，30只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，于湖南中醫藥大學清潔級動物實驗中心飼養，實驗單位許可證號：SYXK（湘）2013-005。動物分籠飼養。環境溫度為（22±4） ℃，濕度為50%±10%，自由進食進水，飼料為標準普通飼料（湖南中醫藥大學動物實驗中心提供），并保持環境安靜，定時清掃鼠籠衛生。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物管理和使用委員會的要求，適應性喂養1周后進行試驗。

1.2 ?試劑

低糖DMEM基礎培養（美國Gibco公司，批號8657263）;FBS胎牛血清（美國Gibco公司，批號42A0071K）;雙抗（美國Gibco公司，批號1999384）;Trypsin-EDTA（美國Gibco公司，批號1868583）;PBS（美國Hyclone公司，批號AD1779227）;CCK-8試劑盒（上海七海復泰生物科技有限公司，批號20190124）;FITC anti-mo/rat CD29抗體（美國eBioscience公司，批號11-0291-80）;FITC anti-rat CD90抗體（美國Biolegend公司，批號206105）;CD34（美國Abcam公司，批號ab81289）;CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（美國Proteintech公司，批號SA00013-2）等。

1.3 ?儀器

HR30-IIA2型生物安全柜（中國海爾集團公司）;311型CO2培養箱（美國賽默飛世爾科技公司）;AE2000型倒置顯微鏡（中國麥克奧迪實業集團公司）;低速離心機（美國萊伯特公司）;DCW-3510型恒溫水浴鍋（中國寧波新芝生物科技股份有限公司）;全身雙能X線骨密度儀（北京中西遠大科技有限公司）;MIAS型醫學圖像分析系統（成都泰盟軟件有限公司）;Ni-U型研究型正置顯微鏡（日本株式會社尼康公司）;A00-1-1102型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）等。

2 方法

2.1 ?動物分組及造模

按照隨機數字表法將30只SPF級雌性大鼠分為空白組、假手術組和模型組3 組，每組10只。模型組采用去除雌性大鼠雙側卵巢方法建立絕經后骨質疏松癥模型[5-6]，現配10%的水合氯醛溶液，濃度為3 mL/kg。假手術組和模型組大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉，俯臥位固定于大鼠板上，剃毛消毒后，沿第一胸腰椎兩側外1 cm處縱向切開皮膚肌肉，分離找到卵巢，結扎后完整摘除兩側卵巢，分兩層縫合切口，用無菌生理鹽水沖洗傷口，絡合碘消毒[7]。術后連續3 d在假手術組和造模組大鼠后腿肌肉內側注射青霉素，每只4萬IU/d，6 d后拆線，空白組不做任何處理。

2.2 ?雌性大鼠陰道脫落細胞涂片

造模后第1天清晨10點，取空白組、假手術組和模型組3組大鼠，用小號無菌棉簽進入大鼠陰道內，輕輕旋轉棉簽后，將陰道分泌物涂抹在已經滴加了少量生理鹽水的防脫玻片上（均勻平鋪即可），待玻片自然風干后進行HE染色，1次/d，連續7 d。將7 d的玻片收集到一塊進行HE染色。

2.3 ?骨密度測定和骨組織HE染色觀察微細結構

造模后第8天，采用頸椎脫臼法處死所有動物。左側股骨組織用于骨密度測定和骨組織HE染色。每組5只雌性大鼠左后肢用濕紗布包裹，送至湖南中醫藥大學藥學院實驗中心送檢，用Unigamma X-RAY Plus雙能X線骨密度儀檢測雌鼠左后肢股骨密度。每組另5只雌性大鼠左后肢去除毛發后固定在4%PFA中，在5%的硝酸中脫鈣7 d，進行HE染色[8]，檢測股骨病理形態學變化。

2.4 ?BMMSCs的分離

造模后第8天，各組大鼠右側骨組織均用于提取BMMSCs。全骨髓貼壁法分離BMMSCs及傳代培養：清潔消毒操作區域，細胞房紫外消毒滅菌30 min，將大鼠右后肢在裝有醫用酒精的燒杯中浸泡2 min后剪去毛發及肌肉顯露骨組織，剪斷骨組織兩端骨骺露出骨髓腔，用預先配制好的DMEM完全培養液沖洗骨髓腔，將沖洗液收集在無菌15 mL BD管中，離心去上清，加完全培養基進行重懸后，轉移至25 cm2培養瓶中，做好組別和P0代標記。

2.5 ?BMMSCs的鑒定

細胞培養至P2代后對細胞進行鑒定。各取100 μL細胞懸液，分別加入到含抗體的離心管中，每種抗體分成5份，3種抗體總計15管，混勻，4 ℃避光孵育30 min，同時設置一管不染抗體管，具體標記如下（未染：不加抗體，不做染色;CD34：染CD34抗體;CD29：染CD29-FITC抗體;CD90：染CD90-FITC抗體），PBS洗細胞2次，800 rpm離心5 min;其中CD34管繼續加入100 μL CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）二抗（1∶100稀釋），繼續避光孵育1 h，PBS洗細胞2次，800 rpm離心5 min，350 μL PBS重懸細胞。上機檢測，進行細胞形態學觀察及表面標記抗原CD90、CD29和CD34的鑒定。

2.6 ?BMMSCs生長曲線測定

將P2代細胞胰酶消化，加入完全培養液終止消化后800 rpm離心5 min，去上清，重新加入完全培養液，對細胞懸液進行計數。經預實驗發現，BMMSCs在濃度為2×104個/mL時，CCK-8試劑盒檢測結果較為理想。該細胞生長周期為7 d，所以繪制完整的生長曲線需要7塊96孔板。按2×103個/孔，每孔100 μL接種到96孔板當中，依次加入空白組、假手術組、模型組細胞懸液，每組做5個復孔。第1天，在各孔中加入CCK-8溶液10 μL，4 h后在450 nm波長處進行OD值測定，依次7 d，繪制BMMSCs的生長曲線。

2.7 ?統計學分析

本實驗數據采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行分析。計量資料用“x±s”表示，多組間分析用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?動情周期判斷

由圖1可知，空白組和假手術組的大鼠有穩定的動情周期，模型組則持續性在動情前期和動情間期，動情周期紊亂。動情前期，陰道脫落細胞大部分是有細胞核上皮細胞，偶見少量角化上皮細胞;動情期，可見大部分無核角化細胞;動情后期階段，白細胞、有核上皮細胞和角化細胞伴行出現;動情間期時，白細胞不斷增多，角化細胞持續減少，直到后期以白細胞為主。

3.2 ?雌性大鼠股骨密度測定

與空白組比較，假手術組股骨密度差異無統計學意義（P>0.05）。與假手術組比較，模型組股骨密度降低，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖2。

3.3 ?股骨HE染色結果分析

空白組和假手術組骨膜完整，骨小梁致密且寬，骨領中有數量較為豐富的成骨細胞，可見初級骨化中心與骨髓腔形成，許多初級骨髓腔融合成一個不斷增大并加長的骨髓腔;模型組骨髓腔較小，細胞種類少，骨小梁稀少且窄，小梁間距加大，骨膜較不完整。如圖3所示。

3.4 ?BMMSCs的鑒定

流式細胞儀鑒定后發現，模型組BMMSCs的CD90、CD29陽性表達分別為63.41%和50.99%，而CD34陽性比為5.31%。結果如圖4所示。

3.5 ?BMMSCs生長速率OD值曲線

空白組、假手術組和模型組第3天和第7天生長速率OD值見表1。與空白組比較，假手術組生長速率差異無統計學意義（P>0.05），與假手術組比較，模型組生長速率均顯著降低（P<0.01）。

從圖5可以看出各組BMMSCs的生長曲線呈“S”形，空白組和假手術組進入對數生長期正常，為第3天，模型組進入對數生長期較慢，為第4天。從第2天起，各組BMMSCs的生長加快。第3天起，與空白組比較，假手術組生長速率差異無統計學意義（P>0.05）。與假手術組比較，模型組生長速率差異降低（P<0.01），細胞進入對數生長期以后，生長趨勢一致。第7天細胞生長速率不再增加，趨于平穩。各組生長速率趨勢為：空白組=假手術組>模型組。

4 討論

人類疾病的動物模型是生物醫學研究中所建立的，能模擬人類疾病表現的動物實驗對象，是現代生物醫學研究的一個重要手段[6]。從動物模型中可較為客觀地反應疾病特點，對科學研究具有一定幫助。由于骨質疏松癥是一種病程較長的疾病，在不同階段有不同的特點，雌性大鼠作為手術去勢造模的方法已較為成熟。隨著基礎研究的深入，判定去勢造模的依據將會越來越接近臨床實際，為患者和疾病規律探索作出貢獻。

手術去勢法造模因素單一，重復性強，具有較高的可信度，但是雌激素水平突然迅速地降低，這與自然病程中雌激素長期、緩慢地下降不一致[3]。陰道脫落細胞具有較易涂片、在體實驗和操作相對簡便的特點，且細胞類型經染色固定后形態很難發生改變，能動態反應動情周期中各期的細胞類型，但在遇上陰道感染時，也可見大量白細胞，難以與以白細胞為主的動情間期相區分，常易因操作不當導致假陽性[9]。雙能骨密度儀測取的骨密度方法具有準確度高、測量時間短的優點[10]，是檢測為骨質疏松癥的“金標準”。王德志等[11]在動物實驗研究中觀察到，骨密度的降低程度在骨質疏松癥的發生、發展過程中不能完全反映骨組織微結構的退變程度，認為評價骨質疏松癥嚴重程度及骨組織力學的改變時，不能單純憑測量骨密度來決定，在實驗研究和臨床工作中應該結合其他檢測方法來共同評估骨質疏松癥。股骨HE染色看到的骨小梁形態變化和骨髓腔加大現象是骨生成的體現，伴隨有初級骨髓腔的形成，顯示骨發生現象。去卵巢后大鼠骨量的丟失主要發生在以骨小梁為主的松質骨[12-13]，由于松質骨在大鼠骨中占大部分，因此，骨小梁的減少會導致骨密度的下降。骨組織HE染色對于股骨端和脛骨端的皮質骨的研究沒有松質骨充分，作為去勢指標的判定具有一定的局限性。BMMSCs是一種具有多種分化能力的細胞，既能成骨分化，又能成脂分化。去除卵巢后的大鼠BMMSCs功能受到抑制，其原代培養具有一定的時間周期，培養條件相對繁瑣。

在大鼠去勢造模判定方法中，有一系列評價的客觀指標，主要有骨密度測定、骨組織形態計量學和陰道脫落細胞涂片檢測等，其中最主要的是骨密度與骨組織病理學變化這兩項指標[14]，本論文主要采用觀察陰道脫落細胞涂片、股骨骨密度的測定、骨組織病理學變化和BMMSCs生長周期變化4種方法證明去勢是否成功。結果發現相較于假手術組，模型組雌性大鼠陰道脫落細胞動情周期紊亂;股骨密度顯著降低，骨組織HE染色骨小梁間距增寬，骨小梁稀少且窄;模型組BMMSCs生長速率變緩，呈現衰老趨勢。相較而言，股骨密度測定和陰道脫落細胞涂片是較為省時、省力且結果較為準確的量化標準。目前，任何骨檢測方法均有其各自的局限性和適用情況，本研究力圖從手術去勢造模角度出發，對大鼠骨質疏松癥模型建立進行“宏觀到微觀、二維到三維、定性到定量”分析，為單一項目實驗方案動物去勢判定提供了較為全面的依據。

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