非小細胞肺癌中p-mTOR、Beclin1及Atg1蛋白表達及其臨床意義

張秀義 許浩然 孫亞東

細胞周期調控基因突變導致細胞正常增殖調節失控及抗凋亡功能異?？哼M是發生腫瘤的重要原因，細胞自噬(autophagy)是與細胞凋亡相似的生物學過程，是細胞內折疊錯誤、老化的蛋白質及受損、失去作用的細胞器在溶酶體內降解的過程[1]?，F代研究顯示自噬作為一種細胞內大分子物質的降解通路，對細胞生存起多種作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信號通路是重要的自噬信號調節通路，磷酸化的mTOR(p-mTOR)是通路活化的生物學標志[2]。自噬相關基因Beclinl是自噬過程中最重要的正調節因子，主要誘導自噬的啟動[3]。自噬相關蛋白Atg(autophagy related gene)在自噬不同階段發揮不同的作用，Atg1是誘導自噬通路啟動階段最關鍵、最直接的蛋白質，受mTOR的調控，誘導自噬的下游信號[4]。既往研究顯示p-mTOR、Beclin1及Atg1通過調節細胞自噬活性，在多種腫瘤發生、發展過程中起重要作用。肺癌是目前中國病死率最高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的絕大多數，探討三者在NSCLC中表達及相關性的研究較少，本研究應用免疫組化方法測定p-mTOR、Beclin1及Atg1蛋白在非小細胞肺癌的表達水平，分析其表達與臨床病理特征是否存在相關性，探討細胞自噬在NSCLC發病中的作用機制。

資料與方法

一、一般資料

收集承德市中心醫院心胸外科于2017年3月到2018年3月行外科手術治療的NSCLC病例 96例(患者術前均未進行化療、放療及其他抗腫瘤治療，所有病例資料均真實、完整)，其中女性34例，男性62例，年齡48～75歲，平均年齡61.4歲。手術切除標本證實有鱗狀細胞癌病例50例，腺癌病例46例；低中分化癌病例58例，高分化癌病例38例；無周圍淋巴結轉移病例56例，存在周圍淋巴結轉移病例40例。NSCLC多發生于支氣管粘膜上皮及肺泡上皮，本實驗設正常支氣管和肺泡雙正常對照組，標本取自肺癌同側遠端距離腫塊3～5 cm的支氣管及肺泡正常組織，其中支氣管粘膜標本60例，肺泡標本64例。本研究獲得我院醫學倫理委員會批準，病理切片經病理科醫師診斷證實。

二、檢驗方法

1. 主要試劑： 兔抗人p-mTOR、Beclin1及Atg1單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，免疫組化試劑盒及DAB試劑盒購自丹麥 Dako公司。

2. 常規組織學處理： 組織標本經福爾馬林溶液浸泡、固定，石蠟包埋、切片，HE染色。根據2004 版WHO肺癌組織學分類標準判定腫瘤組織學分類，根據患者臨床資料確定臨床病理特征。

3. 免疫組織化學檢測： 采用SP免疫組織化學法染色，DAB顯色，應用已知p-mTOR、Beclin1及Atg1蛋白為陽性的組織切片作陽性對照，采用PBS液代替一抗為陰性對照。

4. 結果判定： 采用光學顯微鏡雙盲法觀察染色后切片，p-mTOR、Beclin1及Atg1蛋白均為細胞質染色，每張切片隨機選取5個400倍視野，其中陽性結果判定以細胞著色強度及著色細胞數占觀察細胞總數百分比綜合判定，百分比取平均值：<5%判定為0分，6～25%判定為1分，26～50%判定為2分，≥51%判定為3分。著色強度：不著色判定為0分，淺黃色判定為1分，棕黃色為2分，黃褐色判定為3分。上述兩項得分相加，≤3分判定為陰性結果，>3分判定為陽性結果。

三、統計學方法

結 果

一、Beclinl蛋白表達水平組間比較

Beclinl蛋白在NSCLC中表達陽性率為31.25%(30/96)，如圖1A-D，肺泡及支氣管表達陽性率分別為75.0%(48/64)、66.67%(40/60)，Beclinl蛋白在NSCLC中表達水平顯著低于對照組(χ2=29.418、18.723，P<0.01)。Beclinl蛋白在肺鱗癌中陽性表達率為32.0%(16/50)，顯著低于對照組(χ2=21.079、13.115，P<0.01)。Beclinl蛋白在肺腺癌中表達陽性率為30.43%(14/46)，顯著低于對照組(χ2=21.612、13.677，P<0.01)。Beclinl蛋白在對照組之間表達差異無統計學意義(χ2=1.044，P=0.307)。

二、p-mTOR蛋白表達水平組間比較

p-mTOR蛋白在NSCLC中表達陽性率為66.67%(64/96)，肺泡及支氣管黏膜表達陽性率分別為10.94%(7/64)、18.33%(11/60)，p-mTOR蛋白在NSCLC表達水平顯著高于對照組(χ2=48.316、34.554，P<0.01)。p-mTOR蛋白在肺鱗癌中表達陽性率為72.0%(36/50)，顯著高于對照組(χ2=44.553、32.099，P<0.01)。p-mTOR蛋白在肺腺癌中表達陽性率為60.87%(28/46)，顯著高于對照組(χ2=30.758、20.258，P<0.01)。p-mTOR蛋白在對照組之間表達差異無統計學意義(χ2=1.365，P=0.243)。

三、Atg1蛋白表達水平組間比較

Atg1蛋白在NSCLC中表達陽性率為26.04%(25/96)，如圖2A-D，肺泡及支氣管黏膜表達陽性率分別為81.25%(52/64)、80.0%(48/60)，Atg1蛋白在NSCLC表達水平顯著低于對照組(χ2=46.883、43.178，P<0.01)。Atg1蛋白在肺鱗癌中表達陽性率為26.0%(13/50)，顯著高于對照組(χ2=34.963、32.194，P<0.01)。Atg1蛋白在肺腺癌中表達陽性率為26.09%(12/46)，顯著高于對照組(χ2=33.473、30.81，P<0.01)。Atg1蛋白在對照組之間表達差異無統計學意義(χ2=0.031，P=0.86)。

圖1 Beclinl蛋白水平在肺鱗癌、肺腺癌中的表達；注：A：肺鱗癌Beclinl蛋白陽性(HE染色 SP×100)；B：肺鱗癌Beclinl蛋白陽性(HE染色 SP×400)；C：肺腺癌Beclinl蛋白陽性(HE染色 SP×100)；D：肺腺癌Beclinl蛋白陽性(HE染色 SP×400)

圖2 Atg1蛋白在肺鱗癌、肺腺癌中的表達；注：A：肺鱗癌Atg1蛋白陽性(HE染色 SP×100)；B：肺鱗癌Atg1蛋白陽性(HE染色 SP×400)；C：肺腺癌Atg1蛋白陽性(HE染色 SP×100)；D：肺腺癌Atg1蛋白陽性(HE染色 SP×400)

四、Beclinl蛋白表達水平與腫瘤直徑、分化程度及淋巴結轉移相關性分析

NSCLC中Beclinl蛋白表達水平與腫瘤直徑、分化程度及淋巴結轉移顯著相關，隨著腫瘤體積增大、分化程度下降及出現淋巴結轉移，Beclin1蛋白表達水平呈現下降趨勢，見表1。

表1 非小細胞肺癌中Beclinl表達水平與臨床病理特征的關系

五、p-mTOR蛋白表達水平、腫瘤分化程度與淋巴結轉移的相關性分析

隨著腫瘤分化程度下降及出現淋巴結轉移，p-mTOR蛋白表達水平呈升高趨勢，見表2。

表2 非小細胞肺癌中p-mTOR表達水平與臨床病理特征的關系

六、NSCLC中Atg1蛋白表達水平與腫瘤直徑、淋巴結轉移的相關性分析

隨著腫瘤體積增大及出現淋巴結轉移，Atg1蛋白表達水平呈現下降趨勢，見表3。NSCLC組織中Beclin1、Atg1蛋白表達水平正性相關，p-mTOR與Beclin1及與Atg1表達水平均呈負性相關。

討 論

細胞自噬是細胞器和大分子物質降解的細胞程序性、非凋亡性死亡，通過降解自然衰老及因環境壓力受損的細胞器及長壽命、合成或折疊錯誤的蛋白質，分解為小分子成分，實現受損細胞器自我修復、蛋白質循環利用、加強蛋白質檢驗點的檢查糾錯作用，穩定基因組、保持細胞自穩狀態。正常組織中自噬活性長期受到抑制，細胞自穩及糾錯功能無法有效發揮，有害因素在細胞內持續積累，導致腫瘤發生，因此保持基礎、適當水平的自噬活性對生物體極其重要。在多種人類惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌細胞中均發現自噬正性調節因子缺失，而在腫瘤細胞中，大分子物質通過自噬降解為小分子物質，為腫瘤細胞提供營養物質，促進其生長，一旦出現自噬受抑，可觀察到由環境壓力導致的細胞凋亡增多?？梢娮允稍趯δ[瘤起雙重作用，在正常組織中是對抗細胞癌變的防御機制，起抑癌作用，而對已經惡變的組織，能使腫瘤細胞耐受嚴苛環境，起促癌作用。

表3 非小細胞肺癌中Atg1表達水平與臨床病理特征的關系

Atg1蛋白是絲氨酸蘇氨酸激酶，是自噬通路啟動階段最關鍵、最直接的因子，Atg1與 Atg13、Atg17形成復合體后能夠增強自身酶活性，從而誘導細胞自噬的發生，其活性受mTOR的調控。mTOR通路是調控細胞生長、增殖、自噬的重要信號通路，mTOR作為雷帕霉素的靶分子，具有絲氨酸蘇氨酸激酶活性，是調控Atg1復合體活性的最主要上游分子。mTOR信號通路過度活化在多種腫瘤組織中被發現[5]。p-mTOR表達水平是mTOR通路活化程度的最敏感指標。研究顯示p-mTOR在惡性腫瘤中呈異常高水平表達，顯示其能抑制細胞凋亡、促進腫瘤生長的特征[6]。mTOR 通過與Atg1結合形成復合體，抑制Atg1的激酶活性，進一步抑制自噬的發生。

本文結果顯示NSCLC組織中p-mTOR的表達水平顯著升高，而Atg1的表達水平顯著下降，印證p-mTOR通過與Atg1結合形成復合體，抑制Atg1發揮激酶活性，進一步抑制自噬的發生。由于腫瘤細胞自噬受到抑制，已經出現惡性傾向的細胞不能被清除掉，細胞惡性化逐漸積累，最終導致癌變發生。

Beclin1基因是哺乳動物細胞中發現的唯一的特異性自噬基因，其編碼蛋白與磷酯酰肌醇3激酶家族Ⅲ形成自噬體，調節Atg蛋白在自噬前體結構中的定位，和它的上下游信號調節蛋白組成細自噬控制通路，在調節自噬活性、激活程序性細胞死亡過程中扮演重要角色，是重要的抑癌蛋白。研究證實Beclin1基因缺失及蛋白表達減少與腫瘤發生顯著相關，小鼠細胞Beclin1等位基因被敲除后，惡性病變幾率明顯增加，Beclin1+/-突變小鼠較野生型小鼠更容易發生肺癌、肝癌和淋巴癌[7-8]。人類多種惡性腫瘤存在Beclinl基因失表達，卵巢癌突變率最高達75%，乳腺癌突變率也高于50%，乳腺導管癌、胰腺癌及宮頸癌中編碼Beclinl蛋白的mRNA明顯減少，相應蛋白表達水平也顯著降低，乳腺癌細胞中穩定超表達Beclin1可降低癌細胞增殖和轉移能力，應用基因技術抑制Beclin1基因表達可導致舌鱗癌細胞的自噬水平下降，腫瘤生長加速[9-10]。也有研究發現Beclin1在原發性肝癌中的表達水平明顯升高，Ahn證實結直腸癌和胃癌組織中存在Beclin1過表達，而幾乎沒有或很少在正常胃及結直腸組織中表達[11-13]。不同部位腫瘤組織中表達水平存在明顯差異可能與Beclin1對細胞自噬過程調整的雙重性有關。

本文結果顯示Beclin1蛋白在NSCLC中表達顯著下降，提示其直接增強細胞自噬活性，是最重要的正向調控基因[14-15]，其基因雜合缺失及蛋白表達減少是正常細胞發生惡性轉化的重要原因之一。既往實驗證實前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌中均存在Beclinl單等位基因缺失突變[16-18]，本實驗結果與上述研究結果相一致，Beclinl蛋白在非癌組織中表達量高于肺癌標本，而在癌旁組織中表達差異無統計學意義，表明Beclinl在NSCLC中發揮抑癌作用，提示自噬活性在NSCLC中明顯降低，驗證了在NSCLC中，自噬體形成減少，自噬發生強度減弱。由于腫瘤細胞自噬功能下降、凋亡不足，導致異常細胞繼續存貨，異常細胞持續增加，最終出現腫瘤進展。

研究證實p-mTOR在低分化胃癌表達水平明顯高于高分化胃癌[19-20]。朱倫等[21]證實在食管鱗癌中p-mTOR表達率隨癌組織分化程度升高而降低。本實驗發現p-mTOR表達水平與腫瘤分化程度顯著相關，癌組織分化越好，p-mTOR表達水平越低，與現有研究結果相一致，提示p-mTOR正性調控腫瘤相關蛋白質合成，與肺癌細胞增殖及惡性傾向密切相關[22-24]。本實驗證實p-mTOR表達水平越高，出現淋巴結轉移幾率越大，腫瘤臨床分期越靠后，預后越差，對判斷預后有重要意義。本實驗顯示p-mTOR表達水平與NSCLC患者年齡、性別、組織學類型和腫瘤直徑等均無相關性。

本文結果顯示Atg1和Beclinl蛋白均在腫瘤體積較小、尚未出現淋巴結轉移及Beclinl蛋白在腫瘤組織分化尚可時的表達水平較高，提示二者在腫瘤早期表達活躍，仍發揮一定的促進自噬作用，以抑制腫瘤進展，其表達水平隨腫瘤體積增大、分化惡化而下降，考慮持續基因低表達及蛋白缺失使腫瘤細胞自噬功能下降、凋亡不足，導致本應該通過凋亡或自噬性死亡的細胞生長呈現無節制、不受控狀態，異常細胞持續累積，最終導致癌變。Atg1和Beclinl在出現淋巴結轉移NSCLC病例中呈現明顯低表達，考慮肺癌局部浸潤及遠處轉移與其低水平表達關系密切，提示其完全失活多發生在腫瘤晚期，逐漸喪失其抑癌功能，更具侵襲性和轉移能力，因而預后較差，在NSCLC的研究結果一致[25]。

本文結果發現在NSCLC中Beclinl和Atg1蛋白表達正性相關，推測兩者作為細胞自噬調節通路的上下游靶點，在肺癌發生、浸潤及轉移中發揮協同抑癌的作用，其同步低水平表達導致細胞自噬能力降低、內環境自穩能力障礙。p-mTOR蛋白表達分別與Beclinl和Atg1蛋白表達負性相關，p-mTOR在細胞自噬過程中具有門控作用，其活性是自噬體形成和成熟的關鍵[26-29]。它在腫瘤細胞中通常被激活，是細胞自噬的負性調節因子，細胞自噬的許多信號傳導通路都要經過mTOR通路，故p-mTOR是細胞自噬最主要的抑制性因子。腫瘤形成以后， Beclin1、Atg1的高表達促進自噬發生，mTOR陰性者對自噬的抑制作用減弱，二者所誘導的持續激活的自噬導致腫瘤細胞發生自噬性細胞死亡，從而產生腫瘤抑制作用。在腫瘤的發生、發展中，mTOR、Beclinl可能通過不同的信號通路各自發揮其自噬調控作用。Beclinl基因通過結合Ⅲ型PI3K，促進自噬的發生，而mTOR受其上游的I型PI3K信號轉導通路的調控，抑制自噬活性，Beclinl過表達促進自噬的發生，mTOR被激活，抑制自噬活性，并且Beclinl過表達產生的自噬促進作用遠大于mTOR過表達產生的自噬抑制作用。

自噬現象因細胞周圍環境不同、疾病發展的不同階段及給予不同的治療干預措施，會對細胞會產生不同影響：細胞自噬可降低DNA突變概率、促進細胞凋亡、抑制腫瘤生成；在癌前病變期，自噬受到抑制，細胞內環境穩態無法維持，基因組錯誤率增加，致癌突變累積，正常細胞出現惡性轉化；腫瘤進展期對營養物質需求增加，通過自噬彌補營養不足，保護癌細胞免受化療藥物的作用并延長腫瘤細胞生存時間，幫助其度過應激狀況，使腫瘤細胞在惡劣環境中生存和發展。深入研究p-mTOR、Beclin1及Atg1在肺癌演變過程中的作用機制，為NSCLC早期診斷及預后評價提供理論基礎，探索通過采用蛋白抑制劑靶向干預自噬，誘導腫瘤細胞自噬死亡，防止肺癌的侵襲和轉移，為肺癌的早期預測及個性化治療提供新思路。