苦參有效部位對人參黑斑病菌的抑菌研究

王彩云 陸承雙 常豐華

摘 要 采用超聲波提取工藝獲取苦參總生物堿，用藥物二倍稀釋法與菌落抑制率公式觀察計算苦參總生物堿對人參黑斑病菌的抑菌作用，并測定用藥時的抑菌濃度范圍;同時采用孢子萌發法和生長速率法，對苦參中總黃酮提取物對人參黑斑病菌的抑制效果進行研究。實驗結果表明：不同苦參總生物堿濃度對人參黑斑病菌絲和孢子均具有抑制作用，在苦參總生物堿濃度為10 mg·mL-1及以上時與空白對照組相比，對人參黑斑病菌絲的抑制率為98.8%，孢子的抑制率為100%?？鄥⒖傸S酮溶液含量達到0.1 g·mL-1（10%）時，抑菌效果最佳。

關鍵詞 苦參;總生物堿;總黃酮;人參黑斑病

中圖分類號：R284.1 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.29.076

苦參為豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，味極苦。其主要藥用成分為苦參堿和氧化苦參堿[1]，其重要化學成分還有黃酮類[2]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料

人參黑斑病菌從吉林農業科技學院人參種植基地患有黑斑病的人參葉片上培養分離取得。

培養基為PDA培養基（用于制藥敏瓊脂培養基，承接分離純化的黑斑病菌和盛放不同濃度的苦參總黃酮溶液）。

1.1.2 實驗儀器

超聲波提取機、鼓風干燥箱、精密恒溫水浴鍋、醫用離心機、循環水式多用真空泵、密封型手提式粉碎機、萬分之一電子天平、生物顯微鏡、冷藏柜、隔水式電熱恒溫培養箱、手提式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺、旋轉蒸發儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦參總生物堿的提取

取苦參根部，洗凈曬干，切片粉碎，稱取100 g粉末，苦參藥材粗粉以10倍量的0.2%鹽酸溶液進行超聲波提取，控制提取條件為時間40 min，功率500 W[3-4]。提取液用紗布初過濾后，取得濾液，在離心轉速為3 000 r·min-1的離心機上離心5 min后，取得上清液，在上清液中加入3%的氫氧化鈉，調pH值為8.5[5]，靜置，析出沉淀，干燥備用。

1.2.2 苦參總黃酮提取及溶液的制備

用粉碎機將苦參飲片粉碎，得苦參細粉，并稱取50 g，用濾紙將其包好放置于索式提取器的提取管中，再向燒瓶中加入95%的乙醇溶液，通冷凝水，加熱回流，連續提取6 h，用旋轉蒸發儀對提取液進行濃縮[6]，然后使用柱層析法對濃縮液中的總黃酮進行分離[7]，得到較純的苦參總黃酮溶液，再使用95%的乙醇對分離得到的總黃酮溶液進行定容，使溶液濃度為5 g·mL-1，最后將溶液分裝于10 mL具塞試管中，密封，置于4 ℃的冰箱內保存，備用。

1.2.3 人參黑斑病菌的分離與培養

1）取高溫滅菌后的培養皿，在超凈工作臺中倒入已滅菌的PDA培養基20 mm，待冷凝后制作成平板，放入冷藏柜備用。

2）采集人參種植基地出現黑斑病病斑的人參葉片，用流水沖洗數遍。于無菌環境下，切下帶有人參黑斑病菌的病斑葉片數塊，并把病斑葉片放入70%乙醇溶液中消毒2～3 s，再放入0.1%的升汞溶液中消毒30 s，最后用無菌水沖洗數次，并用滅菌后的吸水紙除去葉片上的水分，減少細菌滋生。將葉片置于PDA培養基平板上，每個PDA培養基平板放4～6塊，然后把培養皿倒置于電熱恒溫培養箱中，在25 ℃下培養4～7 d。數日后觀察菌落生長狀況，最后將分離純化的菌株保存于PDA斜面上，置4 ℃冰箱備用[8]。

1.2.4 采用二倍遞減稀釋法稀釋苦參總生物堿和總黃酮

苦參總生物堿分別配制成40 mg·mL-1、20 mg·mL-1、10 mg·mL-1、5 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、0.312 5 mg·mL-1、0.156 3 mg·mL-1共9個不同濃度的供試藥液。

苦參總黃酮溶液濃度分別為15%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%共6個不同濃度的供試藥液。

1.2.5 藥敏瓊脂培養基的制備

1.2.5.1含苦參總生物堿和總黃酮溶液的培養基制備

用移液槍分別吸取每個苦參總生物堿供試藥液濃度1 mL，加入已滅菌的培養皿中，再趁熱倒入已滅菌的PDA培養基20 mL，順時針輕搖晃，保證供試液與培養基混合均勻，制成含供試藥液的培養基[9]。每個濃度倒3皿，每皿約20 mL，9個濃度梯度，一個空白對照。并按照此方法對含苦參總黃酮溶液的培養基進行制備。

1.2.5.2苦參總黃酮對照組和農藥處理組PDA培養基的制備

按照如上方法分別向滅菌的PDA培養基中加入95%的乙醇溶液和濃度為1 200 mg·mL-1的代森錳鋅可濕性粉劑溶液各2 mL。

1.3 藥敏試驗

1.3.1 各個濃度的供試藥液對黑斑病菌絲生長影響

人參黑斑病菌培養7 d后，選擇均勻且長勢好的菌落，用打孔器打出直徑8 mm的菌餅數個，分別置于空白組、含苦參總生物堿、含苦參總黃酮溶液、含代森錳鋅農藥的供試藥液培養基平板的中心，各個濃度的供試藥液培養基和空白對照培養基每個3皿，每個培養基各放入一個菌餅。放培養箱中培養7 d，并設定溫度為25 ℃，最后采用十字交叉法來測量菌落的直徑，各個濃度測量3次，求平均值，用以下公式計算抑制率[10]。

1.3.2 各個濃度供試藥液對黑斑病孢子萌發的影響

人參黑斑病原菌培養孢子7 d后，在超凈工作臺上選取生長良好、活力強病菌孢子，用無菌水配成10倍視野下100～120個病菌孢子的菌懸液。菌懸液對供試藥液進行稀釋，按計算好的400 μL中需加入不同濃度的供試藥液量，用菌懸液稀釋至400 μL并加入6孔凹板板孔中，放入恒溫培養箱中培養1 d后，計算孢子萌發率和抑制率[11]。

1.3.3 數據分析

本次抑菌實驗每個濃度重復3組，空白對照一組。實驗結果采用SPSS 22.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 苦參總生物堿對人參黑斑病菌菌絲生長的影響

苦參總生物堿各不同濃度對人參黑斑病菌絲的生長均表現出抑制作用，人參黑斑病菌在濃度為10 mg·mL-1及以上的總生物堿供試藥液培養基上，菌絲生長抑制率為98.8%。具體情況見表1。

2.2 苦參總生物堿對人參黑斑病菌孢子萌發的影響

苦參總生物堿不僅可以抑制人參黑斑病菌絲生長，而且還對黑斑病病菌孢子的萌發產生抑制作用。當總生物堿藥液濃度為10 mg·mL-1及以上時，孢子萌發抑制率為100%，具體情況見表2。從表中可以看出，各個濃度總生物堿藥液對孢子萌發均有較好抑制效果，證明總生物堿藥液對人參黑斑病孢子的生長有抑制作用。

2.3 苦參總黃酮對人參黑斑病菌菌絲生長的影響

不同濃度苦參總黃酮溶液對人參黑斑病菌菌絲產生了不同程度的抑制作用，濃度越高，抑菌率越高，濃度在10%時，苦參總黃酮溶液的抑菌率為81.3%，高于農藥組，且呈顯著性差異，具體情況見表3。

3 結論

本試驗屬于人參葉片上黑斑病的室內離體試驗，利用苦參提取物總生物堿對PDA培養基里的黑斑病菌落進行處理，觀察其菌落和孢子是否停止生長或消失，從而檢測苦參總生物堿是否對人參黑斑病有抑菌作用。試驗結果表明，接菌后7 d，5 mg·mL苦參總生物堿藥液處理的菌絲抑制率達94.4%;5 mg·mL苦參總生物堿藥液濃度處理的孢子萌發抑制率為96.5%。在濃度為10 mg·mL及以上時與空白對照組相比，菌絲的抑制率為98.8%，孢子的抑制率為100%?？鄥⒖傸S酮對人參黑斑病菌菌絲生長的影響結果表明，濃度為10%及以上的苦參總黃酮溶液對人參黑斑病菌的抑菌效果最佳。本次試驗數據表明，苦參總生物堿及總黃酮對人參黑斑病菌絲生長有抑制效果，苦參總生物堿對人參黑斑病孢子萌發也有一定抑制效果，這為研發新型植物源農藥奠定了基礎，可降低了農藥大量使用對環境造成的污染。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

[2] 楊志欣，李霞，單柏松，等.苦參總黃酮的研究進展[J].中成藥.2016，38：165-169.

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[6] 黃琦.苦參黃酮類化合物的提取分離和生物活性研究[C].廣東藥科大學，2017.

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[10] 袁靜，關麗杰，叢斌，等.苦參生物堿抑菌生物活性測定[J].農藥，2005（2）：86-89.

[11] 李翔國，韓蓮花，吳松權等.木醋液對人參黑斑病菌和人參灰霉病菌的抑菌作用[J].中藥材，2014，37（9）：1525-1528.

（責任編輯：趙中正）