高壓熱殺菌技術滅活細菌芽胞機理研究進展

申 瑾， 郭家俊， 陳 翔， 吳 珊， 包軍鵬， 章 中

(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021)

1 HPTS技術簡介

高壓熱殺菌技術(High-pressure Thermal Sterilization，HPTS)是指將靜態超高壓和熱耦合起來用于殺菌，通常所用壓力為400～900 MPa，通常所用溫度為50～90 ℃。HPTS殺菌技術比傳統熱殺菌技術的熱處理強度低，可以生產出質量更高的食品[1]。隨著消費者對天然、新鮮、安全和最少加工食品的需求日益增長，HPTS引起了人們極大的興趣。HPTS是一種新興的生產貨架穩定、低酸食品的技術，能滅活細菌芽胞，并使食品具有較好的感官和營養品質[2]。目前，HPTS還沒有廣泛地應用于食品工業中，部分原因是由于其殺滅細菌芽胞的機理尚不為人知。

2 芽胞對食品保藏與安全的影響

芽胞是細菌營養體在缺乏營養的環境條件下形成的休眠態，可以休眠幾萬年以上而復活，對各種殺菌處理(如輻照、超高壓、熱、超聲波、微波、化學物質等)有最強的耐受能力。在食品工業中，常因為殺菌強度不夠而發生由芽胞導致的食品腐敗和食物中毒問題[3]。高抗性芽胞的殺滅是低酸性食品安全的一個關鍵問題[4]。芽胞萌發后迅速生長而引起低酸性食品腐敗。有數據顯示，每年有35%的果汁污染與嗜酸芽胞桿菌有關, 歐洲果汁協會2011年的調查發現,45%的果汁生產企業發生過脂環酸芽胞桿菌污染引起的腐敗事件[5]。美國佛羅里達州市售的180種熱帶和亞熱帶的水果濃縮汁中,6.1%的樣品存在脂環酸芽胞桿菌污染現象[6]。有報道分析了新西蘭乳業超過10年的數據,證實乳粉中嗜熱芽胞的數量有時<10 個/g,有時可>105個/g，對乳粉造成了很大損害[7]。同時芽胞也在對人體造成危害，芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌的芽胞可導致多種食源性疾病，從輕微的嘔吐到危及生命的毒素中毒。據報道地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌與某些食源性疾病的暴發有關[8-9]。

3 細菌芽胞的結構及其殺菌抗性

芽胞的極端殺菌抗性與其特殊結構緊密相關[8,10-12]。芽胞的結構與其營養體非常不同。芽胞從外到里有七層結構，分別是孢外壁、芽胞衣、外膜、皮層、細胞壁、內膜、內核[13]。孢外壁是芽胞的最外層，由碳水化合物和蛋白質組成，不同類型的芽胞，孢外壁的大小差異很大，而且這層結構與芽胞的抗性沒有任何作用[14]。芽胞衣主要由蛋白質構成，它使得芽胞對許多化學物質有抗性，也能保護芽胞免受外源皮層裂解酶的攻擊。芽胞衣之下是外膜，它之下是芽胞的皮層(cortex)。皮層占芽胞體積36%～60%，皮層的滲透壓為2.0 MPa左右，含水量70%，略低于營養細胞(80%)，但比芽胞整體的平均含水量高出許多,芽胞的皮層對其抗壓性有關鍵影響。皮層之下是芽胞的細胞壁，由肽聚糖構成，接下來是芽胞的內膜，它是完整的，是生長中的細胞胞質膜的類似物，具有很強的滲透性屏障，阻礙了損傷DNA的化學物質進入，芽胞萌發后內膜成為營養體的細胞膜。

芽胞內核的一個重要生物化學特性就是其水分含量極低，僅有25%～50%，而營養體細胞水分含量為80%左右，芽胞核心含水量低是導致其休眠和耐熱性的關鍵因素之一[11]。皮層通過擠壓核心來促進水分的流失，這伴隨著DPA的積累。芽胞中的DPA含量高，DPA含量約占內核干重的20%，其鈣鹽是細菌芽胞殺菌抗性的原因之一[15]。小分子酸溶性蛋白(Small acid-soluble protein, SASP)占芽胞內核總蛋白的3%～6%。缺乏a/β SASP的突變芽胞對紫外線、熱、過氧化物、電離輻射和其他殺菌處理的敏感性提高。

4 HPTS對細菌芽胞的殺滅作用

4.1 HPTS對細菌芽胞的殺滅效果

Ahn等[16]報道了HPTS處理下牛奶中嗜硬脂熱芽胞的數量減少了6個對數值。Ates等[17]報道HPTS(650 MPa、65 ℃、10 min)能殺滅4.5個對數的枯草芽胞桿菌芽胞。Evelyn等[18]報道HPTS處理下牛肉泥中蠟樣芽胞桿菌芽胞減少了4.9個對數值。Evelyn等[19]研究了芽胞對熱、高壓熱處理和單獨熱處理的抗性差異的比較發現HPTS(600 MPa、75 ℃)處理蠟樣芽胞桿菌芽胞具有顯著效果。Izabela等[20]發現在300 MPa、50 ℃、15 min條件下處理蘋果汁，能有效殺滅蘋果汁中的酸土脂環酸芽胞桿菌芽胞，且蘋果汁濃度會影響殺滅效果。隨著殺菌壓力和溫度的升高，芽胞萌發和失活也在增強。L. Reverter-Carrióna等[21]發現在壓力為200、300 MPa，溫度為50、70 ℃都能有效殺滅芽胞。Maier MB等[22]報道HPTS(600 MPa,100 ℃)處理下肉毒梭狀芽胞桿菌減少了6個對數值。

4.2 HPTS處理下細菌芽胞滅活動力學

預測HPTS滅活芽胞的數學模型可以讓制造商預測和控制食品的安全性和貨架穩定性。Zhu等[23]研究了HPTS殺滅生芽胞梭狀芽胞桿菌PA3679芽胞的動力學，對于壓力從700 MPa到900 MPa、溫度為80 ℃時，D值為15.8到7.0 min。Gao等[24]研究了食品成分對HTPS處理下嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞死亡程度的影響，建立了二次模擬方程來預測食品成分和pH值對HPTS處理下芽胞死亡的影響。得出大豆蛋白質、豆油等和食品的pH值能顯著地影響該菌芽胞對HPTS的抗性。Silva等[25]用一階Bigelow模型很好地描述了HPTS對酸土脂環酸芽胞桿菌芽胞的殺滅效果。Wang等[26]報道嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞對HPTS的耐受力比凝結芽胞桿菌芽胞強，Log-logistic模型對芽胞死亡曲線的擬合效果最好，Weibull模型次之。Luu-Thi等[27]報道HPTS(300～600 MPa、60～100 ℃)能殺滅蠟樣芽胞桿菌芽胞，HPTS處理下芽胞死亡初期較快、后期較慢，但兩個階段均可用一級動力學模型描述。Evelyn等[28]報道HPTS(400～600 MPa、70 ℃)能殺滅牛奶中的蠟樣芽胞桿菌芽胞，Weibull模型能很好地描述芽胞死亡動力學。Uchida[29]報道HPTS(600 MPa、65 ℃)能殺滅酸土脂環酸芽胞桿菌芽胞，隨著芽胞懸浮液中可溶性固形物濃度升高，殺菌動力學曲線的D值增大。

5 HPTS殺滅芽胞的機理

目前，HPTS對細菌芽胞的良好殺滅作用已得到公認，但對HPTS殺滅芽胞的機理尚不完全明確。當前主要有兩種觀點，第一種觀點認為HPTS直接破壞了芽胞結構或鈍化了芽胞的酶，從而殺滅芽胞。第二種觀點認為HPTS先導致芽胞萌發，芽胞萌發后失去極端抗性而被殺滅。

5.1 HPTS直接破壞芽胞結構或鈍化芽胞內源酶

曾慶梅等[30]研究了HPTS對枯草桿菌芽胞超微結構的影響，采用透射電鏡進行觀察，觀察結果表明：超高壓處理后枯草芽胞桿菌的營養體細胞壁皺縮，出現缺口，胞漿泄漏，結構層次感消失，出現大片透電子區；其芽胞外殼被破壞，出現缺口，芽胞內含物結構紊亂，泄漏，出現部分透電子區，甚至內含物質完全泄漏，出現細胞壁或孢子外殼殘留，芽胞大量被殺滅。高瑀瓏等[31]采用比色法研究了HPTS對枯草芽胞桿菌與嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞的影響，結果表明，HPTS處理芽胞能夠顯著提高芽胞DPA的泄漏率(P<0.05)，能夠破壞芽胞的結構，芽胞內膜通透性屏障被破壞，顯著提高了芽胞DPA的泄漏率，實驗結果說明HPTS殺滅枯草芽胞桿菌與嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞的原因可能是其物理結構被破壞。劉潔等[32]使用了HPTS處理芽胞，研究了連續式施壓和間歇式施壓兩種不同方式對枯草桿菌芽胞的滅活作用。結果表明，經掃描電鏡觀察，芽胞外殼出現凹陷、皺褶等形態變化，這種間歇式的施壓產生強烈的機械剪切力，造成芽胞結構損傷及內容物的泄漏，甚至死亡。Black等[33]研究高壓和nisin對牛乳中芽胞桿菌芽胞萌發和滅活的共同作用，經過透射電鏡觀察，發現HPTS處理后，芽胞的結構有明顯損壞，出現凹陷和空洞，并且核心內容物似乎不存在。2013年章中等人研究乙醇協同HPTS處理后枯草芽胞桿菌芽胞，通過透射電鏡觀察發現，未經處理的芽胞光滑且圓潤，皮層清晰，皮層和芽胞核區都沒有電子透射區，在HPTS 處理后，有些芽胞的皮層被水解，芽胞內出現了大面積的電子透射區，芽胞被壓垮，芽胞的核心出現紊亂。Wang等[34]研究高壓和微酸性電解水對蠟樣芽胞桿菌芽胞結構的影響，采用掃描電鏡、透射電鏡、超分辨多光子共聚焦顯微鏡等研究了芽胞的生理反應，結果表明，HPP-SAEW處理蠟樣芽胞桿菌，芽胞形態有部分損傷，芽胞壁不完整，芽胞表面有不規則的突起，甚至有嚴重的變形。芽胞的殺滅主要是不依賴于萌發，而是直接被殺滅。Akasaka等[35]首次將高分辨率高壓核磁共振光譜應運于枯草芽胞桿菌芽胞懸浮液中，并直接實時監測了DPA在 200 MPa、20 ℃壓力下的泄漏過程。發現在200 MPa、20 ℃下，三分之一的DPA立即泄漏，其余的只有在減壓時才緩慢泄漏，而且一旦DPA從內核中耗盡，在80 ℃左右，它們的蛋白質很容易變性，且芽胞衣、內外膜和皮層等芽胞特有結構基本被破壞，從而導致芽胞失活。

5.2 HPTS導致芽胞萌發而被殺滅

芽胞萌發是指在某種條件下芽胞從休眠態轉變成營養體細胞的過程。芽胞一旦萌發后殺菌抗性就會大大降低[36-38]。Setlow[39]報道芽胞萌發被劃分為兩個階段，第一階段會有陽離子釋放、DPA釋放、芽胞核心的部分水化、部分殺菌抗性的散失。第二階段會有皮層的水解、芽胞核心的進一步水化、芽胞核心的膨脹、殺菌抗性的完全散失。兩階段完成后，芽胞的新陳代謝開始恢復，SASP被降解，大分子物質開始合成，新的營養體細胞從芽胞衣中脫離出來。很多報道稱芽胞萌發過程中殺菌抗性的散失與以下因素有關，即DPA的釋放、芽胞內膜通透性的增加，SASP的降解和皮層的水解等。

5.2.1 HPTS處理下芽胞DPA釋放導致其萌發進而被殺滅 許多報告認為DPA釋放是在HPTS條件下滅活細菌芽胞的關鍵步驟。Paidhungat等[40]發現550 MPa的壓力處理打開了芽胞DPA的釋放通道而導致芽胞萌發。Margosch等[41]研究了細菌芽胞的殺菌抗性，得出在600～800 MPa和60 ℃以上的溫度下，DPA主要是通過物理化學過程而不是生理過程釋放的，發現HPTS處理下芽胞的滅活和DPA的釋放密切相關。Clery-Barraud等[42]將突變衍生體RP42菌株的炭疽桿菌芽胞暴露于HPTS處理下(280～500 Mpa、10～360 min、20～75 ℃)，測定芽胞的失活動力學，研究表明，HPTS能完全殺滅炭疽桿菌芽胞，可能是HPTS處理下DPA釋放，而誘導了芽胞萌發，萌發后的炭疽桿菌芽胞殺菌抗性降低。Black等[43]發現枯草芽胞桿菌芽胞在500 MPa、50 ℃下能快速萌發，這個過程是通過超高壓直接引起DPA的釋放，隨后引起芽胞的萌發而不是通過作用于芽胞的營養萌發受體引起芽胞萌發。得出誘導芽胞釋放DPA并萌發的最佳溫度約60 ℃。并推測VHP可能作用于芽胞內膜而導致DPA釋放，但作用靶點尚不明確。黃娟等[44]以凝結芽胞桿菌芽胞、嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞為研究對象，研究了HPTS的對其失活、萌發、損傷方面的影響，研究表明，當較低壓力(≤300 MPa)和初溫(≤60 ℃)時能有效誘導兩種細菌芽胞的萌發；當較高壓力(≥500 MPa)和較高溫度(≥80 ℃)時，兩種芽胞的失活率趨于接近。此外，對比常壓熱處理與HPTS處理對芽胞的不同影響發現，HPTS對芽胞的萌發、失活影響明顯大于常壓熱處理，但熱仍是造成芽胞損傷的一個重要因素。Vercammen等研究了HPTS對番茄醬中凝結芽胞桿菌和脂環酸芽胞桿菌芽胞萌發和失活的影響，發現在600～800 MPa下, 芽胞的萌發與溫度關系極大, 在60 ℃時，在所有處理壓力和時間條件下觀察到芽胞滅活，并且滅活程度幾乎等于萌發程度。Reineke等[45]通過研究芽胞特有物質DPA釋放和芽胞熱敏感性增加的情況，認為HPTS殺滅芽胞的機制涉及三個步驟：①休眠②激活③殺滅。隨著處理強度的增加，芽胞的滅活程度大大增加，當壓力超過一定閾值時，溫度成為影響芽胞萌發的主導因素。Hofstetter等[46]對HPTS與reutericyclin或Nisin聯合處理下嗜熱桿菌芽胞內膜流動性進行了原位測定。結果表明，在不改變內膜高度有序狀態的情況下，芽胞可以被HPTS滅活，而且，reutericyclin 和Nisin對芽胞內膜流動性的不同影響有助于研究HPTS誘導芽胞釋放DPA和失活。Erika Georget等[47]采用原位紅外光譜(FT-IR)和熒光光譜法研究了硬脂酸桿菌芽胞在HPTS處理下萌發和失活的機理，芽胞內膜用 Laurdan 熒光染料染色。在HPTS處理下，原位記錄了紅外光譜和熒光光譜。發現在200 MPa和55 ℃條件下，芽胞DPA快速且全部釋放，HPTS導致了芽胞萌發，萌發率可達3個對數值，從而殺滅芽胞。Robert Sevenich等[48]采用平板計數法、高效液相色譜法和流式細胞儀(FCM)檢測HPTS處理對DPA釋放、芽胞滅活及芽胞內膜的影響，發現DPA的釋放對HPTS處理下的芽胞失活至關重要，DPA的釋放是芽胞滅活的限速步驟，而芽胞內膜可能是HPTS作用于芽胞的靶結構。

5.2.2 HPTS導致芽胞內膜通透性增加而被殺滅 芽胞萌發時其內膜通透性會增加。HPTS會導致芽胞內膜通透性增加而將其殺滅，主要是由于HPTS處理下水分子穿透內膜屏障并進入芽胞內核，使芽胞的抗性降低而將其殺滅。Mathys等[49]使用流式細胞儀研究了HPTS對地衣芽胞桿菌芽胞的殺滅機理,采用SYTO16和碘化吡啶對HPTS處理后的芽胞進行染色, 研究芽胞內膜通透性變化, 提出了一種包含三個步驟的HPTS殺滅芽胞機理, 依次為芽胞皮層水解和芽胞萌發、一個未知步驟、芽胞內膜被破壞而失活。Zhang等[50]研究了HPTS結合不同濃度乙醇對枯草芽胞桿菌芽胞的殺滅作用。乙醇協同HPTS處理后芽胞的內膜通透性大大增加并嚴重受損，隨著乙醇濃度的提高和水分的減少，HPTS殺滅芽胞的效果降低，進一步表明水分子進入芽胞內核對HPTS殺滅芽胞有至關重要的作用。章中[51]通過透射電鏡觀察HPTS處理前后的枯草桿菌芽胞，發現未經HPTS處理的芽胞內核顏色很深、內容物致密緊湊，而經HPTS處理的芽胞內核顏色變淺，這個現象說明經HPTS處理后，芽胞內膜水分子通透屏障受損，水分子進入芽胞內核，發生了水合現象。Sevenich等[48]用氯化鈉和蔗糖調節芽胞懸浮液的水分活度，發現隨著水分活度的降低，水分通過芽胞內膜進入芽胞內核的量越少，HPTS對芽胞的滅活能力下降。Rozali等[52]采用掃描電鏡對HPTS處理前后芽胞的形態進行觀察，發現芽胞具有不可逆的體積和形狀變化。細菌芽胞的失活被認為是從芽胞內膜受損開始的，而芽胞內膜通透性的增加會促進芽胞內核DPA的釋放和含水量的增加，進而導致芽胞死亡。

5.2.3 HPTS導致芽胞SASP降解或皮層水解而殺滅芽胞 SASP是一個多基因族的產物，這個多基因族僅在出芽后期表達。SASP僅存在于芽胞的核心，占芽胞總蛋白含量的5%。SASP的關鍵功能是和芽胞DNA結合在一起，這種結合使得芽胞DNA更為穩定并免受許多物理損害，芽胞萌發后期SASP會降解[53]。芽胞的皮層主要由肽聚糖構成，在芽胞萌發早期就被降解。目前認為HPTS處理下芽胞皮層肽聚糖水解機理僅有兩種可能性, 其一是HPTS激活皮層裂解酶, 其二是HPTS導致皮層肽聚糖的非酶水解。在休眠的芽胞中, 皮層裂解酶不表現出活性, 但在芽胞萌發而轉變成營養體的過程中, 皮層裂解酶通過某種機制被激活并將皮層肽聚糖水解, 然后導致芽胞核心的完全水化，這是芽胞萌發過程中的一個重要步驟[13]。Mathys等[54]認為,HPTS處理下芽胞內部的DPA的釋放可能會激活皮層裂解酶, 從而將芽胞皮層水解, 進而導致芽胞死亡。Reineke等[55]報道HPTS很可能會影響皮層裂解酶的活性, 在某些壓力和溫度條件下, 皮層裂解酶可能會被激活, 導致芽胞皮層水解而萌發, 進而使得芽胞結構被破壞。章中[51]研究乙醇協同HPTS處理后枯草桿菌芽胞的透射電鏡觀察，高濃度的乙醇抑制了芽胞皮層裂解酶的活性，皮層肽聚糖未能被水解，而肽聚糖水解是芽胞萌發的一個關鍵步驟，這一步驟被抑制導致芽胞萌發過程受阻，乙醇協同HPTS處理下芽胞仍然有抗熱抗壓性，其內部結構受影響小，不易被HPTS殺滅。

6 展 望

HPTS能殺滅食品中的所有微生物，包括最難被殺滅的細菌芽胞，使得食品能在常溫下長期貯藏，和傳統高溫熱殺菌相比，HPTS使用的溫度較低、時間較短，能更好地保持食品原有的色、香、味、質構、營養素和功能性成分，受到國內外食品科學家的廣泛關注。細菌芽胞需要高強度的殺菌處理以確保食品安全和保藏效果，芽胞的殺滅是食品殺菌的關鍵任務。HPTS作為一種新型殺菌技術，其優點鮮明，然而其殺滅芽胞的機理卻遠不夠清楚，研究報道較少。HPTS仍會對食品的營養和感官品質造成一定的影響，加深對HPTS殺滅芽胞機理的理解可有利于降低這種不利影響。通過研究，希望在殺滅食品中各種芽胞的同時盡可能地保持食品原有的營養和感官品質。

目前對HPTS殺滅細菌芽胞機理的研究主要集中在處理前后芽胞結構和關鍵物質的變化上，而對芽胞結構和關鍵物質在HPTS處理下的實時動態變化研究少之又少。芽胞內膜通透性屏障的損傷是HPTS殺滅芽胞的一個關鍵原因，未來我們可以采用金剛石對頂砧技術結合拉曼光譜法、傅里葉變換紅外光譜法、落射熒光單分子顯微術、熒光分光光度法、X射線衍射、核磁共振等技術，以芽胞內膜磷脂大分子為研究切入點，通過實時動態研究HPTS處理下芽胞內膜磷脂分子側向熱運動、相態和分子間氫鍵作用的變化規律，從多個層次和不同角度闡明HPTS微物理場中芽胞內膜流動性變化的原因，最終揭示HPTS微物理場中芽胞內膜水分子通透屏障受損的分子機理，進一部夯實HPTS殺菌技術的理論基礎，推動HPTS技術在食品工業中的應用。