膠原誘導性類風濕關節炎大鼠模型制備及早期表現評價 *

蘇云龍, 王雪梅

(1.內蒙古鄂爾多斯市中心醫院CT-MRI室,內蒙古 鄂爾多斯市 017000, 2.內蒙古醫科大學附屬醫院)

類風濕關節炎(RA)是一種免疫炎癥性疾病,常常導致關節疼痛和僵硬,關節結構性損傷及功能性殘疾[1,2]。如果不在早期進行及時有效的治療,病情一般發展迅速,大約有90%的病人在2a后可導致關節畸形或殘疾,從而使生活質量和工作能力嚴重下降[3，4]。

動物模型在類風濕關節炎治療藥物篩選和發病機理研究等方面有非常重要的作用。目前,類風濕關節炎動物模型的制備方法有很多種,但是大多數模型建立的周期都比較長、成功率也比較低,嚴重影響RA的進一步深入研究。Ⅱ型膠原免疫誘導類風濕關節炎模型的臨床表現、病理改變與人類RA比較相似,是被公認的最佳類風濕關節炎動物模型[5]。本文通過Ⅱ型膠原乳劑免疫誘導的方法制備大鼠 CIA 模型,并對其進行病理學及影像學方法進一步評價,試圖找出類風濕關節炎大鼠模型早期研究的最佳時期。

1 材料及方法

1.1 材料

健康雌性Wistar 大鼠(清潔級),60只,體重185～205g,周齡8～9wk。飼養1wk后分成2組,CIA組50只;空白對照組10只。牛Ⅱ型膠原(產地美國Sigma公司),足爪體積測量儀(自制,專利號:ZL201420335087.3),X線機(GE公司)。

1.2 方法

1.2.1模型建立 CIA組大鼠用型膠原乳劑分別行初次免疫與加強免疫兩次給藥的方法建立模型。將大鼠用水合氯醛麻醉后,分別在尾根部和背部脊柱兩側多點皮內注射乳劑。初次免疫分別在CIA組大鼠的尾根部和背部(0.2～0.4mL/只)皮內注射型膠原乳劑,初次免疫2wk后,同樣將型膠原乳劑分別在尾根部和背部皮內注射(劑量為0.3mL/只)進行加強免疫?？瞻讓φ战M大鼠將同等劑量的生理鹽水分別在尾根部及背部皮內注射做為陰性對照。

1.2.2觀察測量內容及評分

1.2.2.1觀察大鼠的臨床表現

造模前及造模后每5d測一次實驗大鼠體重,并記錄臨床特點變化情況,其中包括大鼠的飲食量、體毛的顏色改變、關節腫脹程度及活動度。

1.2.2.2計算關節腫脹度

采用排水法用自制的足爪體積測量儀測量大鼠足爪體積,并分別計算出各足爪的腫脹度。從造模后(注射藥物開始免疫后)0～45d每隔5d用足爪體積測量儀檢測一次足爪的體積,每個足爪每次要測定三次,最后算出平均值。關節腫脹度計算公式為:關節腫脹度=(測量值-造模前所測值)/造模前所測值×100%。

1.2.2.3評分

造模后每5d觀察并記錄一次實驗大鼠四肢關節部位的病變情況,然后行大鼠關節炎指數評分,根據每個關節的病變情況累計積分,即為每只大鼠的AI值(Arthritic Index,關節炎指數)。評分3分以上的大鼠為肉眼觀察造模成功的模型。

評分標準:0分:無任何異常;1分:個別足趾關節有輕微腫脹;2分:大部分踝關節及足趾關節輕度腫脹,并有紅斑;3分:踝關節及以下關節中度腫脹(腫脹度在40%～50%);4分:踝關節及以下關節重度腫脹(腫脹度在51%～75%);5分:踝關節及以下關節嚴重腫脹(腫脹度大于75%)。

1.3 χ線顯像

造模前及造模后15d、25d、45d對實驗大鼠進行踝關節放射X光檢查,χ線機攝片設置參數條件為40KV。閱片由2位高級職稱放射科醫師分別進行,重點觀察實驗大鼠關節部位軟組織腫脹情況,關節面是否有破壞,關節間隙有無狹窄等。

1.4 病理檢測

實驗大鼠造模后45d斷頸處死,切取包括踝關節在內的整個足爪進行病理檢測。最后由兩位有高級職稱的病理醫師分別進行病理閱片,重點觀察大鼠關節部位的病理變化,關節滑膜是否有炎細胞浸潤,以及關節滑膜增厚情況,特別是血管翳形成及關節面下的骨、軟骨破壞情況等。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 實驗大鼠的一般狀態

空白對照組大鼠隨著飼養時間的增加,飲食良好,活動自如,毛發光澤,足爪未見明顯腫脹。CIA組大鼠在造模后3～5d頭部毛發開始發紅,體溫明顯升高。造模后4～7d注射部位出現紅腫和炎性小潰瘍或結節,并逐漸加重,部分出現破潰。造模后8～12d毛發發紅現象開始改善,破潰處逐漸有硬痂形成,而后結痂逐漸脫落。在造模5d后CIA組大鼠逐漸出現精神萎靡,飲食量明顯減少,活動度減少,體毛無光澤干枯發黃,并有脫毛情況。

2.2 實驗大鼠體重變化情況

空白對照組大鼠在飼養過程中體重是逐漸增加的。CIA組大鼠在造模后體重增長較正常大鼠明顯緩慢,有部分大鼠體重有所下降。在造模25d后與同時間點空白對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05),在造模40d后與同時間點空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 造模后不同時間點各組大鼠體重(g)

2.3 實驗大鼠踝關節局部的觀察情況

空白對照組大鼠踝關節無腫脹,足爪局部是正常的粉紅色,足爪體積也沒有明顯變化。CIA組大鼠在造模后第10d足爪局部可見有紅斑,隨后足爪紅斑及腫脹程度逐漸加重,活動不便。到造模后第25d,CIA組大鼠共有78個足爪關節出現不同程度紅腫及軟組織腫脹,且大部分為后足,病變關節屈曲及活動受限,30d后紅腫程度有所緩解,但持續輕-中度腫脹。

2.4 CIA組及空白對照組大鼠足爪體積的變化情況

空白對照組大鼠足爪體積在整個測量過程中增加穩定,各時間點前后差異沒有統計學意義。CIA組大鼠在造模后15d足爪體積開始明顯增加,與同時間點空白對照組大鼠足爪體積差異有統計學意義(P<0.01),CIA組大鼠在造模30d后足爪體積雖然稍有下降,但與同時間點空白對照組大鼠足爪體積差異仍有統計學意義(P<0.01)(見表2)。

表2 空白對照組與CIA組大鼠造模后的足爪體積表(ml)

2.5 CIA組及空白對照組大鼠關節炎評分結果

CIA組大鼠在造模后每5d進行一次四肢關節部位的關節炎指數評分,四肢評分值相加得總評分(0分～20分),評分在8～10分是比較嚴重的。在造模10d后隨著免疫反應的發展,AI 值逐漸增加,并且各時間點 AI值均與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.01),其中30d時達峰值,之后稍有下降,在造模后25～45d中,評分3分以上的大鼠共有36只,其中,共有53個關節評分大于3分,而且大部分為后足關節,前足較少,成模率為72%(見表3)。

表3 空白對照組與CIA組大鼠造模后的評分表

2.6 關節的病理結果

空白對照組大鼠踝關節部位滑膜層未見炎細胞浸潤,關節內無纖維增生,滑膜層未見增厚。CIA組大鼠踝關節滑膜層有炎細胞浸潤,滑膜細胞數量可見明顯增多,肥大的細胞排列不規則,滑膜細胞層數明顯增厚,而且增生的滑膜可見有血管翳形成,并爬行到軟骨面,開始侵蝕軟骨及骨,部分有軟骨及骨的侵蝕破壞。

3 討論

類風濕關節炎是一種發病機制不明的自身免疫疾病[6],有研究發現遺傳因素及生活環境與RA的患病風險密切相關。有效的實驗動物模型是研究RA疾病早期發病機制的基礎,建立合適的動物模型也為RA的診斷及治療方法的研究提供了有力的保障,本文運用Ⅱ型膠原免疫誘導的方法成功建立了CIA模型,模型成功率是72%。

本文研究發現,CIA組大鼠在造模3d后陸續出現頭部毛發發紅、體溫明顯升高,進食量減少,活動減少,體重增長緩慢或下降等臨床表現,這可能是體內的免疫應答反應導致的。CIA組大鼠在造模后15d足爪體積開始明顯增加,在造模后25d體重及足爪體積與空白對照組差別均有統計學意義。在造模后25dCIA組大鼠踝關節軟組織腫脹及紅腫程度達到高峰,且大部分為后足。而且在整個實驗過程中,CIA組大鼠足爪在造模25d時是腫漲高峰期,這與相關文獻一致[7,8]。在造模后30d時CIA組大鼠AI值達峰值,之后稍有下降,但在造模后25～45d中評分均值都在5分以上,這可能是由于急性水腫期導致的。在造模后25d,CIA組大鼠X線片顯示關節面光滑,關節間隙未見狹窄,而在45d后部分關節邊緣可見有骨質破壞,說明在造模后45d時部分模型動物已經有關節功能的永久性損傷。

本實驗研究結果證實,在造模后25d左右可能是膠原誘導性類風濕關節炎大鼠模型的發病早期,而在造模后45d部分動物模型已接近大鼠類風濕關節炎的中晚期,所以在造模45d后已經不適合對Ⅱ型膠原免疫誘導類風濕關節炎早期表現的研究。因此,本研究提示對早期膠原誘導性類風濕關節炎大鼠模型的研究應該在造模后25d左右進行,尤其是對類風濕關節炎早期發病機制及治療的實驗研究。