天敵昆蟲耐冷藏力研究進展

王瑞珍，張 楊，王曉丹，宋麗文，李 宏，劉鑫榮，李興鵬

(1. 北京市植物園/北京市花卉園藝工程技術研究中心，北京100093；2. 吉林省林業科學研究院，長春 130033；3. 長春市綠園區農林水利管理服務站，長春 130062；4. 北華大學林學院，吉林 132013)

低溫冷藏是一種增加天敵昆蟲保存期的有效方法，該方法的應用可為生物防治提供持續和大量天敵。低溫冷藏有利于在害蟲大爆發的關鍵時期及時釋放天敵，從而達到有效防治害蟲的目的(McDonald and Kok, 1990; Venkatesanetal., 2000)。低溫冷藏不僅有利于天敵昆蟲的工廠化生產，其對實驗昆蟲種群的保存也起著至關重要的作用。此外，低溫冷藏還可用于寵物飼料、魚餌、法醫鑒定指示昆蟲飼養以及一些瀕危昆蟲物種的保護等(Leopold, 2007)。一般情況下，低溫冷藏是指為了減緩昆蟲發育和代謝速率而將昆蟲放置在0℃以上的亞致死低溫環境以延長貨架期的過程(Hanceetal., 2007)，而冷藏后昆蟲存活率、生殖力以及活動力等是評價昆蟲耐冷藏力的主要參數(Chenetal., 2011)。這些參數受冷藏前、冷藏中甚至冷藏后經歷的一系列內源和外源因子的影響。因此，了解這些因子對昆蟲耐冷藏力的影響對于天敵耐冷藏力的提高具有至關重要的作用。

1 外源因子對昆蟲耐冷藏力的影響

影響昆蟲耐冷藏力的外源因子主要有冷藏環境(溫度、濕度、光周期、氧濃度)、冷藏持續時間、冷藏前的預處理、冷藏過程中的溫度處理(混合低溫)等。

1.1 冷藏環境對昆蟲耐冷藏力的影響

大多數昆蟲低溫冷藏的適宜溫度范圍為0～15℃(van Lenteren and Tommasini, 2002)。一般情況下，冷藏溫度越低，死亡率越高(Lysyk, 2004; Rundleetal., 2004; Lopez and Botto, 2005; Pandey and Johnson, 2005; Luczynskietal., 2007)。冷藏實驗設計通常包括特殊的溫度以及確定發育起點溫度閾值(T0)(Leopold, 2007)。冷藏溫度的選擇應該在相對較低的代謝及發育速率和低溫對昆蟲冷害的平衡之間選擇。如果冷藏溫度過高，冷藏期間就會出現試蟲羽化等現象(Pitcheretal., 2002)。在一些天敵昆蟲種類中，溫度閾值幾乎都接近發育起點溫度。Pandey和Johnson(2005)研究表明長索跳小蜂Anagyrusananatis幼蟲在溫度為14.8℃條件下(發育起點溫度為12.6℃)冷藏時間超過8周后其羽化率依然高達93.2%，與對照組(95.1%)相比差異不顯著。但當溫度為10.1℃時，兩周內大部分幼蟲死亡。Leptomastixdactylopii(一種跳小蜂)(T0=13.2℃; Tingle and Copland, 1988)在10℃冷藏5 d后全部死亡，但在15℃冷藏35 d后80%以上的個體依然存活(Krishnamoorthy, 1989)。然而在其它一些種類中，在發育起點溫度之下卻會表現出較好的耐冷藏能力。例如桃赤蚜蚜繭蜂Aphidiusmatricariae(T0=4.5℃; Miller and Gerth, 1994)能夠在3.5℃條件下冷藏3周以上(Marwan and Tawfiq, 2006)，麗蚜小蜂Encarsiaformosa(T0=12.7℃; Osborne, 1982)在4.5℃條件下可存活28 d(Lopez and Botto, 2005)，金小蜂Muscidifuraxraptor(T0=9.3℃; Lysyk, 2000)能夠在5℃條件下冷藏12周(Lysyk, 2004)。這些研究表明，冷藏溫度的選擇在很大程度上決定于昆蟲的耐冷藏力，因此在生產實踐中應通過詳細實驗來確定具體種類的最佳耐冷藏溫度范圍。

濕度也是影響冷藏的重要因子之一。當昆蟲體液活性高于周圍環境水的活性時，蟲體循環水開始向外蒸發，從而導致在長期冷藏的狀態下，昆蟲體液平衡遭到嚴重破壞，其體內水分的含量明顯下降(Colinetetal., 2006a; Ismailetal., 2010)。目前只有少數研究調查了濕度對天敵昆蟲冷藏效果的影響。Waggoner等(1997)的研究表明當短翅蚜小蜂Aphelinusasychis暴露在較低的濕度時，其壽命顯著降低。Lacey等(1999)發現將麗蚜小蜂的蛹在相對濕度為30%的環境下冷藏，其成蟲的羽化率要顯著低于相對濕度為70%的環境。過低的濕度可能會進一步加劇低溫對昆蟲的不利影響，但濕度過高又會增加冷藏對象感染病菌的風險(Wilding, 1973; Chen and Leopold, 2007)。

光周期是反映晝夜和季節變化的唯一可靠指標，光周期通過觸發昆蟲生理及生化反應而增加其抗寒性。具體表現形式為滯育，但也有其他表現形式(Tauberetal., 1986; Hodkova and Hodek, 2004)。許多昆蟲種類都具有光周期誘導的抗寒性(Kim and Song, 2000)。然而，光周期對非滯育期昆蟲抗寒性的影響卻鮮有報道。短翅蚜小蜂(雌性)在短日照(10 L ∶14 D)的室溫環境飼養后經5℃冷藏的效果要好于長日照(15 L ∶9 D)(Tatsumi and Takada, 2005)。將寄生于Listronotusoregonensis卵中的Anaphessp.放置于短日照、低溫(8 L ∶16 D，13℃)的環境下，其耐寒力要比放置在長日照(16 L ∶8 D，13℃)的環境中高(Hance and Boivin, 1993)。另外，通過對麗蚜小蜂冷藏力的研究表明，光周期可能還影響昆蟲的生殖力(Ganteaumeetal., 1995)。

除了溫度、濕度以及光周期等氣候因子外，氧氣濃度以及某些化學因子也會對昆蟲耐冷藏力產生一定影響。低氧的環境脅迫有助于非滯育的裝飾短蚋Simuliumornatum卵的冷藏力提高(Golletal., 1989)。與此相反，Leopold(2000)發現低氧環境對家蠅Muscadomestica卵的冷藏能力的提高是無效的。另外，有研究表明化學脅迫能夠顯著影響昆蟲的冷藏效果。將赤眼蜂Trichogrammacordubensis預蛹暴露于3℃、相同劑量的高效氯氟氰菊酯(lambda-cyhalothrin)環境中時，其羽化率只有15%，而對照的羽化率則達到80%以上(Garciaetal., 2009)。上述研究表明低溫環境對昆蟲的損傷與其它環境脅迫因素是相關聯的，比如殺蟲劑脅迫，這可能是由于昆蟲在低溫環境下其解毒酶活性較低，導致其死亡率增加。

1.2 低溫暴露期及溫度處理對昆蟲耐冷藏力的影響

暴露期(低溫冷藏時間)是另一個影響昆蟲低溫冷藏存活率的關鍵因子。Kostal等(2006)認為暴露強度是暴露持續周期和溫度的綜合結果，也就是說當暴露期持續增加或者溫度持續降低，其暴露強度也隨之增加。當這種過程超過了一個冷傷害積累的臨界值后對昆蟲的傷害是不可逆轉的，直至死亡。因此暴露期和溫度的交互作用最終決定了昆蟲的死亡率。大多數的冷藏試驗結果顯示，隨著冷藏周期的增加，其冷藏對象的存活率也隨之降低(Bayrametal., 2005; Colinetetal., 2006a；2006b; Ayvazetal., 2008; Chenetal., 2008a; Colinet and Hance, 2010)。由于冷傷害是一種積累效應，昆蟲的存活率的降低同暴露時間存在一種線性、可預測或者復雜的非線性關系(Lysyk, 2004)。

與植物耐冷藏力提高途徑相似，冷藏前的溫度梯度降低(馴化)可以在一定范圍內有效提高昆蟲低溫冷藏力。按照低溫馴化時間長短，可將昆蟲的低溫馴化分為長期冷馴化和快速冷馴化。長期馴化是昆蟲表型可塑性的一種形式，通過長時間(幾天到幾周)在亞致死溫度下預處理后可提高其耐冷藏力(Chown and Terblanche, 2006; Anguilletta, 2009)。這種溫度馴化包括一系列生理、生物化學修飾(包括蛋白質、代謝物質、生物膜結構以及代謝速率的改變等)(Bowler, 2005)。預冷藏、預處理或者預冷凍等都屬于馴化的范疇。在天敵生產中，一般情況下馴化都會提高試蟲的耐冷藏力(Pandey and Johnson, 2005; Marwan and Tawfiq, 2006; Luczynskietal., 2007)。但馴化也可能對耐冷藏力具有負面影響。例如，將Thripobiusjavae蛹在10℃下馴化10 d后，其羽化時間要比未馴化的長2倍(Bernardoetal., 2008)。在這個研究中，馴化的積極作用被昆蟲發育歷期的延長抵消，因為在馴化期，個體發育正處于對低溫最敏感的時期(Anguilletta, 2009)?？焖倮漶Z化是指將昆蟲在亞致死低溫中暴露幾分鐘至幾個小時以提高其耐冷藏力的過程(李興鵬等, 2012)，是昆蟲表型可塑性的另外一種途徑。目前已被證明存在于大多數昆蟲中(Hoffmannetal., 2003; Chown and Nicolson, 2004)。例如低溫快速冷馴化處理顯著提升煙蚜繭蜂Aphidiusrhopalosiphi冷藏后的存活率(Levieetal., 2005)。盡管快速冷馴化和長期冷馴化涉及不同的生理過程，但最終都會導致積極的效果(Shintani and Ishikawa, 2007)?？焖倮漶Z化能夠提高冷休克(急性應激)和長時間低溫暴露(慢性應激)后的存活率(Lee and Denlinger, 2010)，因此可應用于天敵昆蟲的冷藏及運輸。

與持續低溫暴露相比，波動的溫度變化可以顯著影響部分昆蟲冷藏后的存活率(Renaultetal., 2004; Lee, 2010)。將蚜繭蜂AsaphesvulgarisWalker的蛹定期在合適溫度下短期暴露會顯著提高其存活率(Colinetetal., 2006b)。除了對昆蟲存活率的積極影響，變溫馴化對蚜繭蜂繁殖能力和活動能力(生物防治成功的重要特征因子)的維持方面都具有積極作用(Colinet and Hance, 2009)，這可能是因為溫度的波動變化可給予其自身生理修復的機會(Lalouetteetal., 2007)，提高其逆境下的生存能力。

2 內源因子對昆蟲耐冷藏力的影響

影響昆蟲耐冷藏力的內源因子主要有體能的儲備、繁殖方式、年齡/齡期、滯育(休眠)狀態、營養等。

2.1 體能的儲備對昆蟲耐冷藏力的影響

在冷藏過程中，個體代謝主要依靠蟲體在發育過程中能量的儲備(Renaultetal., 2003)，因此冷藏效果可能是由冷傷害和可消耗能量二者共同作用的結果(Colinetetal., 2006a)。昆蟲的體重(身體大小)和脂質的儲備之間為正相關性，即較大的個體能夠積累較多的脂肪(Rivero and West, 2002; Colinetetal., 2007a, 2007b)。而冷藏能力同蟲體大小的正相關性也已經被證明(Liuetal., 2007)。在冷藏過程中，體重較大的昆蟲其脂肪含量也較高，昆蟲個體的冷藏能力也更高(Colinetetal., 2007b)。研究表明不同寄主種類、年齡以及飼養環境能夠在很大程度上影響天敵昆蟲冷藏前體內能量的儲備繼而影響其耐冷藏力(Cloutieretal., 2000)。

2.2 生殖方式及齡期對昆蟲耐冷藏力的影響

生殖方式的差異也會導致昆蟲耐冷藏力的不同。同一分布區的不同環境壓力可以誘導一些寄生性天敵出現兩性生殖和孤雌生殖。不同的生殖策略同生活史特性具有相關性，例如壽命、發育歷期、生殖力等(Barkeetal., 2005; Pelosseetal., 2007)。不同生殖型之間耐寒(耐熱)能力不同。例如赤眼蜂的產雌個體要比產雄個體具有更高的耐冷藏力(Wang and Smith, 1996)。

同種昆蟲，不同蟲態，其耐冷藏力顯著不同(Bowler and Terblanche, 2008)。例如雙翅目果蠅Drosophilamelanogaster的卵耐冷藏力要顯著高于成蟲(Bowler and Terblanche, 2008)，而另一些膜翅目種類如Cotesiamarginiventris，Telenomusbusseolae，Leptomastixdactylopii等成蟲的耐冷藏力要高于未成熟蟲態(Krishnamoorthy, 1989; Riddick, 2001; Bayrametal., 2005)。同一蟲態在不同發育階段的耐冷藏力也存在差異(Bowler and Terblanche, 2008)。在一些種類中齡期較小的蛹要比齡期較大的蛹具有更高的耐冷藏力(Levieetal., 2005)。而另一些種類則是齡期較大的蛹的耐冷藏力較齡期較小的好(Bueno and Van Cleave, 1997; Venkatesanetal., 2000)。另外也有研究表明，中間齡級蛹的耐冷藏力高于初齡蛹和老齡蛹(Chenetal., 2005; Luczynskietal., 2007)。

2.3 滯育(休眠)狀態對昆蟲耐冷藏力的影響

大量研究表明滯育或者休眠是影響昆蟲耐冷藏力最主要的內源因子。在自然界，昆蟲通過滯育和休眠兩種形式響應季節和溫度的改變(Tauberetal., 1986; Hodkova and Hodek, 2004)。目前大多數昆蟲的滯育誘導機制還不清楚，其滯育的誘導和解除還不能人為控制(Polgár and Hardie, 2000; Colinetetal., 2010)。盡管目前對于冷脅迫和滯育之間相關性還不清楚(Hodkova and Hodek, 2004)，然而，基于少數研究表明滯育中的昆蟲在低溫脅迫后其耐寒能力有所提高。麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis非滯育的幼蟲相比于滯育幼蟲更易受到低溫的傷害(Riversetal., 2000)。煙蚜繭蜂滯育個體具有較高的低溫存活率(Langer and Hance, 2000)。滯育狀態的赤眼蜂在低溫脅迫下未發現死亡，而非滯育個體在冷脅迫過程中死亡率增加(Venturaetal., 2002)。同樣，煙蚜繭蜂的滯育個體在冷脅迫過程中的死亡率要低于非滯育個體(Tatsumi and Takada, 2005)。這種差異在休眠和非休眠昆蟲個體中同樣存在。

2.4 營養源對昆蟲耐冷藏力的影響

營養源是影響昆蟲冷藏力的一個非常重要但又容易被忽略的因子，特別是對一些用人工飼料(替代寄主)飼養的天敵昆蟲，在環境等外源因子受控的情況下，飼料的品質直接決定了天敵發育、生殖以及耐冷藏力等參數。研究表明選擇合適的發育階段、冷藏溫度和飼料配比能夠有效提高天敵昆蟲冷藏效果(Coudronetal., 2007)。例如，有研究報道飼料的營養品質在很大程度上影響了斑腹刺益蝽Podisusmaculiventris冷藏后的存活率和繁殖能力(Thorpe and Aldrich, 2004)。而合適的飼料和預冷藏處理也可提高普通草蛉Chrysoperlacarnea的存活率和繁殖能力(Changetal., 1995)。麗蠅蛹集金小蜂寄生了體內含有更多的抗凍保護劑(甘油，丙氨酸)的滯育的紅尾肉蠅Sarcophagacrassipalpis蛹后其冷藏能力顯著提高(Riversetal., 2000)。用含有蜂蜜或蔗糖的飼料飼喂Cotesiamarginiventris成蟲會顯著提高其冷藏能力(U?kan and Ergin, 2003)。用人工飼料飼養的斑腹刺益蝽成蟲冷藏后的產卵量和卵的孵化率均顯著高于天然飼料(Coudronetal., 2009)，這可能是由于人工飼料蛋白質含量較高而脂類物質含量較低導致(Coudronetal., 2007)。

3 昆蟲耐冷藏力的生理學機制

昆蟲在低溫下的冷害累積會導致各種生理功能障礙(Chown and Terblanche, 2006))。由于低溫冷藏過程中昆蟲停止取食，造成能量儲備耗竭(Renaultetal., 2003; Colinetetal., 2006a)。冷藏實際上是冷脅迫和饑餓兩者共同作用的結果。生物體從環境中獲取并轉化能量資源，以維持它們的體內平衡并繁衍后代(Brownetal., 1993)。因此，對于那些不能從頭合成脂質的昆蟲種類來說其體內能量儲備的消耗，尤其是脂肪，在低溫脅迫期間可被期望轉化為用來維持生存或者繁殖的資本(Renaultetal., 2003; Colinetetal., 2006a; Visser and Ellers, 2008; Visseretal., 2010)。低溫脅迫的影響可能不會被立即觀測到(如死亡率等不受影響)，但這種影響可能會被傳遞到另一階段，即對發育或者生殖力或者兩者都產生消極影響(Chown and Nicolson, 2004)。有些寄生蜂幼體冷藏后能夠完全發育，但其壽命會大幅縮短，因為缺乏脂肪積累，即意味著體內資源分配受到限制(Visser and Ellers, 2008; Visseretal., 2010)。而生存和生殖之間的權衡會嚴重影響脂肪的消耗。Aphidiuscolemani成蟲蟲體脂肪儲備隨著冷藏時間的延長而線性下降，同時，其壽命也呈線性下降(Colinetetal., 2006a)，Aphidiuservi在冷藏期間，壽命的降低同磷脂的消耗也存在相關性(Ismailetal., 2010)。成蟲在羽化過程中需要消耗大量能量來完成肌肉收縮(Yocumetal., 1994)，但冷害誘導了肌肉功能障礙(Keltyetal., 1996)，使神經肌肉功能發生紊亂(Yocumetal., 1994; Keltyetal., 1996)，再加上缺乏能量，導致了一些種類昆蟲在冷藏后不能成功羽化或活動能力降低(Kostaletal., 2006)。

有研究報道冷藏對昆蟲生殖力產生負面影響是由于低溫導致雌性個體卵母細胞的成熟率降低或者卵巢管的畸形而最終導致不育(Hanna, 1935)。一些種類的昆蟲雌性個體與冷藏后的雄性交配后，只產生雄性個體(即不育的卵)，這可能是因為冷脅迫導致了精子的發育或者生殖器官受到損害從而使雄性生殖力喪失(Levieetal., 2005; Pandey and Johnson, 2005)。Lacoume等(2007)的研究也表明冷休克影響了Dinarmusbasalis精子的生產，繼而導致了精子生產和精囊補充的延遲。

對天敵昆蟲來講，搜尋(識別)寄主的能力是評價冷藏效果的一個非常重要的指標，但目前很少有針對冷藏對昆蟲搜尋(捕食或寄生)寄主能力影響的研究。僅有的幾項研究結果表明冷藏可能降低了昆蟲氣味識別蛋白的表達而影響了其對寄主的搜尋能力(Hérardetal., 1988)。

昆蟲在經受低溫脅迫后可通過調節蟲體自由水與結合水的比率(馬延龍等, 2009)、游離脂肪酸與結合脂肪酸比例(強承魁等, 2008)、氨基酸代謝水平(韓瑞東等, 2005)、小分子碳水化合物、多羥基化合物(海藻糖、糖原)以及脂類含量等影響其冷藏能力(Liuetal., 2007; Johannesetal., 2007; Lietal., 2019)。由于取食不同營養組成的飼料后，蟲體內與抗寒性相關的糖原、脂類以及甘油等積累程度和種類以及細胞膜構建物質等勢必存在差異，而這些物質只有在外部環境(比如溫度)發生大的變化時，其功能才能被激活，幫助昆蟲度過不良環境(Cuietal., 2017)。研究表明使用不同營養成分人工飼料繼代飼養的蠋蝽Armachinensis成蟲冷藏后蟲體內小分子碳水化合物、脂肪酸、甘油以及多種酶等存在顯著差異(Lietal., 2019)。這可能是飼料營養組成的差異影響了蠋蝽在冷藏過程中細胞膜的構建物質的組成、蟲體抗寒物質以及跟生殖相關物質的合成和代謝速率，繼而導致了蠋蝽耐冷藏力的差異。另外，已被廣泛證實對植物耐冷藏力具有重要作用的某些金屬陽離子(Monroy and Dhindsa, 1995)，在昆蟲冷藏過程中對昆蟲體內某些抗凍蛋白酶的激活等也同樣具有積極作用。南極蚊Belgicaantarctica接受低溫脅迫時鈣離子作為重要的第二信使調節細胞凋亡率，而且這種調節是不受大腦或神經控制的(Teetsetal., 2008)。這可能是昆蟲在經受低溫時可通過鈣調素依賴蛋白激酶激活某種細胞凋亡調控基因表達來抑制細胞凋亡(Yanoetal., 1998)。

4 小結

綜上所述，冷藏環境、冷藏周期、預處理、營養以及昆蟲自身所處的發育階段、體內能量物質的儲備等多種內源因子和外源因子共同決定了其耐冷藏力。了解影響天敵昆蟲耐冷藏力因子的多樣性對于天敵昆蟲冷藏實驗方案的設計以及天敵昆蟲生產和應用具有重要作用。

除了羽化、壽命、生殖力和性比等顯著指示特征外，其它一些在生物防治中比較重要的特征也受到冷藏的影響，比如擴散能力、覓食行為和交配行為或代際效應也是昆蟲冷藏后質量評價的重要參數?？傊?，天敵在野外的行為是衡量冷藏技術是否成功的依據，但目前的研究很少考慮天敵冷藏后在野外應用過程中的行為特征，因此未來應加強冷藏對天敵昆蟲行為生物學及遺傳特性的影響等方面的研究。