低溫貯藏對鮮食葡萄果實中單萜化合物的影響

王慧玲，閆愛玲，孫磊，張國軍，王曉玥，任建成，徐海英?

1北京市林業果樹科學研究院，北京 100093；2北京市落葉果樹工程技術研究中心，北京 100097；3農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100097

0 引言

【研究意義】葡萄具有很高的營養價值，且味美多汁，是世界五大名果之一。然而葡萄生產具有地域性和季節性的特點，要實現各地周年供應新鮮葡萄，發展貯藏保鮮事業很有必要。低溫冷藏是現代葡萄貯藏保鮮的主要方式[1]。隨著生活水平的提高，人們對葡萄品質的要求也越來越高。香氣是構成葡萄品質的主要因素之一，特別是玫瑰香味深受消費者喜歡[2]。研究采后低溫貯藏期間玫瑰香氣成分的變化規律，將為建立更科學的葡萄貯藏體系，保證葡萄優良風味品質提供理論和實踐依據?！厩叭搜芯窟M展】單萜是葡萄果實中含量最豐富的萜類化合物，被認為是玫瑰香味的主要呈香物質[3]。根據游離態單萜類化合物的含量高低，歐洲種釀酒葡萄品種被分為玫瑰香型（游離態單萜化合物總量高達6 mg·L-1）、非玫瑰香芳香型（游離態單萜化合物總量達1—4 mg·L-1）和非芳香型（游離態單萜化合物總量低于1 mg·L-1）3類[4]。在葡萄果實中單萜化合物以游離態和糖苷結合態存在，一般認為游離態是揮發性化合物，可以被直接感知，與葡萄漿果的香氣有關。而糖苷結合態單萜不易揮發，對葡萄的香氣沒有直接貢獻，但是它們可以通過增加水解作用而轉化為游離態化合物，從而改變葡萄的芳香特性[5]。影響單萜化合物積累的因素很多，除了遺傳基因組成，還受生長環境及栽培技術措施等外在因素的影響[6-8]。然而目前對葡萄單萜成分的研究主要集中在采前階段，在低溫貯藏過程中，果實的理化性質會發生或多或少的變化[9]?？茖W家對葡萄在低溫貯藏過程中的理化特性和貯藏特性進行了研究[10]，并且也做了很多努力來揭示葡萄貯藏過程中維生素和多酚等營養成分的變化[11]。但是關于葡萄在低溫貯藏期間的香氣組成和含量變化研究還比較少，特別是針對大眾喜愛的玫瑰香味的研究更少。成明[12]以‘玫瑰香’葡萄為試材的研究表明，冷庫貯藏期間，葡萄的香氣成分（醛類和醇類）隨著貯藏期的延長，相對含量均呈下降趨勢；主要物質（E）-2-己烯醛、里那醇、橙花醇的相對含量也均呈下降趨勢。張鵬等[13]以‘無核寒香蜜’葡萄為試材，研究發現其主要揮發性成分乙酸乙酯、青葉醛、正己醇、葉醇等化合物在冷藏45 d后相對含量均低于冷藏15 d的果實。盡管MATSUMOTO和 IKOMA[14]研究了不同采后貯藏對‘陽光玫瑰’葡萄果實中玫瑰香味和香氣揮發物含量的影響，但也只研究了單一萜類化合物里那醇含量的變化?！颈狙芯壳腥朦c】綜上可見，葡萄果實在低溫貯藏過程中會發生風味變化，但是仍然缺乏詳細全面的特定代謝物類型和水平的信息。已有的研究也主要集中于游離態化合物檢測，缺乏糖苷結合態香氣化合物的代謝譜數據?！緮M解決的關鍵問題】本研究以兩個優新玫瑰香型葡萄品種‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’為試材，探討低溫貯藏過程中游離態和糖苷結合態單萜組分和含量變化趨勢，從更加全面的代謝物角度詮釋玫瑰香氣成分變化規律，為更好地研究貯藏期間葡萄風味品質的變化和最佳貯藏條件的建立提供理論參考。

1 材料與方法

試驗于2017年8—9月在北京市林業果樹科學研究院進行。

1.1 材料

供試鮮食葡萄品種為‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’，兩者均是北京市林業果樹科學研究院育成的紅色早中熟優新品種，選自‘京秀’和‘香妃’的雜交后代。果肉質地較脆，口味甜香，‘瑞都紅玫’具有明顯的玫瑰香味，‘瑞都早紅’淡淡的玫瑰香味，成熟時可溶性固形物含量均可以達到16%以上[15-16]。試驗植株為露地栽培 7年生自根苗，定植于北京市林業果樹科學院葡萄試驗園內，單臂籬架水平龍干整形，株行距0.75 m×2 m，試驗地土壤肥力中等，pH 6.9。采用簡易避雨、地表園藝地布覆蓋、滴灌供水和常規病蟲害等管理模式，生長期內修剪及肥水管理一致。依據往年物候期記載結合可溶性固形物含量確定兩個品種的成熟期進行樣品采集，貯藏試驗地點在北京市林業果樹科學研究院冷庫（（2±1）℃，90% RH）。

1.2 試驗方法

選擇顆粒飽滿、果粒大小均勻、無病、無機械傷、無落粒的葡萄果穗放入開孔紙板箱，每箱5 kg。預冷至-1—0℃，放入PE葡萄保鮮膜中，封口入庫。每個品種設3—5次重復，每隔15 d進行調查并取樣測試相關指標。

1.3 外觀品質指標測定

失重率：穗重失重率（%）=（貯前穗重-貯后穗重）/貯前穗重×100。爛果率：爛果率（%）=（腐爛果粒的個數/果?？倲担?00。落粒率：落粒率（%）=落粒果重/總果重×100。果柄耐拉力：將葡萄果柄與彈簧秤相連，沿果?？v軸方向拉至果柄從果實上脫離，記錄彈簧秤最終讀數，即為果柄耐拉力，每個處理重復10—20次以上，取平均值。果梗褐變指數：褐變指數（%）=∑（各級穗數×級數）/（最高級數×總穗數）×100；穗軸（果梗）褐變級別：無褐變的為0級，褐變0—1/4為1級，褐變1/4—1/2為2級，褐變1/2—3/4為3級，褐變3/4以上為4級。

1.4 單萜化合物提取

單萜的提取和測定參考WEN等[17]的方法，略有改動。首先葡萄果實樣品去除種子，以避免對揮發性化合物的提取產生任何可能的影響。其余果實部分（約50 g）在液氮中研磨，研磨過程中加入1 g PVPP和0.5 g D-葡萄糖酸內酯。得到的果粉樣品在4℃低溫靜置4 h后，立即在4℃下以8 000×g離心10 min，得到澄清的葡萄汁。澄清葡萄汁直接檢測游離單萜化合物。對每個樣品進行3次獨立提取。

糖苷結合態化合物提取，固相萃取柱（Cleanert PEP-SPE柱，天津博納艾杰爾公司）依次經10 mL甲醇和10 mL水活化后，加入2 mL上述澄清葡萄汁樣品。經2 mL水洗脫去除一些糖、酸等低分子量的極性化合物后，加入5 mL二氯甲烷洗脫，進一步去除大部分游離態香氣物質的干擾，最后用20 mL甲醇將結合態香氣物質洗脫，收集至50 mL的圓底燒瓶內，整個固相萃取過程洗脫劑流速保持2 mL·min-1。所得甲醇洗脫液在旋轉蒸發器下蒸發至干燥，然后重新溶解在10 mL的2 mol·L-1檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.0）中。在40℃的培養箱中，用200 μL 糖苷酶AR 2000（100 mg·L-1，在 pH 5.0 的 2 mol·L-1檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液中）酶解結合型揮發性化合物16 h。每個果汁樣品做2個獨立的重復。

此后，在以下SPME條件下提取游離和結合態揮發物：將5 mL提取液與10 μL 4-甲基-2-戊醇（內標）和1 g NaCl混合在20 mL聚四氟乙烯硅隔膜蓋小瓶中。將樣品瓶在 40℃下的 500 r/min攪拌下平衡 30 min。之后將活化的SPME針頭（Supelco，Bellefonte，PA，USA）插入小瓶頂空，在40℃下吸附揮發性組分30 min。最后，將SPME針頭插入GC進樣口8 min，釋放揮發物。

1.5 單萜化合物檢測

氣相色譜與質譜聯用儀（GC-MS）型號：Agilent 7890B GC和Agilent 5977A MS（Agilent，美國）。毛細管柱為HP-INNOwax（60 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W Scientific，美國）。

GC-MS條件參考WU等[18]發表的方法：載氣為高純氦氣（He，＞99.999%），流速為1 mL·min-1；進樣口溫度為250℃，采樣不分流模式，解析時間8 min；升溫程序為50℃保持1 min，然后以3℃·min-1升溫到220℃，保持5 min。質譜電離方式為EI，離子源溫度為230℃，電離能為70 eV，四級桿溫度為150℃，質譜接口溫度為280℃，質量掃描范圍為30—350 u。

1.6 單萜化合物定性定量分析

數據處理和分析通過 ChemStation軟件（安捷倫科技公司）進行，參考WU等[18]的方法?；衔锸紫雀鶕藴势繁Ａ糁笖岛唾|譜進行鑒定，當標準品不可用時，利用NIST 05標準庫，參考標準品的保留指數和質譜匹配來鑒別?；衔锒渴褂脴藴是€，每種標準品溶于甲醇，然后混合在一起。將混合標準溶液稀釋，以獲得每個分析物的5—12個濃度水平。對沒有可用標準物的揮發物，使用具有相似碳原子或結構的標準物進行量化。

1.7 數據處理與統計分析

數據統計分析利用分析軟件 SPSS 13.0，采用Duncan多重比較進行顯著性分析，最低顯著水平P＜0.05；主成分分析和聚類分析采用MetaboAnalyst 4.0；繪圖采用Excel和Sigma Plot 10.0。

2 結果

2.1 兩個葡萄品種低溫貯藏過程中果實理化和貯藏特性變化

兩個品種葡萄果實可溶性固形物含量在低溫貯藏過程中均表現為逐漸降低的趨勢，‘瑞都紅玫’果實的可溶性固形物含量高于‘瑞都早紅’（圖1）。兩個品種果實中可滴定酸含量在低溫貯藏過程中變化趨勢略有差異，‘瑞都紅玫’中可滴定酸含量在貯藏15 d時有所下降，之后略有上升；而‘瑞都早紅’可滴定酸含量在貯藏30 d內上升，之后在貯藏45 d時略有下降（圖1）?！鸲技t玫’果實中可滴定酸含量高于‘瑞都早紅’。

失重率、爛果率、落粒率、果柄耐拉力、果梗褐變指數等是評價果品耐貯性好壞、商品性優劣的直觀表現。由表1可見，隨著貯藏期的延長，兩個品種的失重率均呈上升趨勢，‘瑞都早紅’在貯藏后期失重幅度增大，貯藏45 d時達到8.57%，‘瑞都紅玫’失重率為 5.46%。在低溫貯藏過程中，‘瑞都紅玫’的爛果率上升幅度較小。而‘瑞都早紅’在貯藏早期爛果率較低（貯藏15 d時僅為1.96%），但貯藏中后期爛果現象比較明顯。在整個貯藏過程中，‘瑞都紅玫’落粒率均比較低，‘瑞都早紅’落?，F象明顯，到貯藏45 d達到50%。兩個葡萄品種果柄耐拉力都隨貯藏時間推移而降低，‘瑞都紅玫’的果柄耐拉力高于‘瑞都早紅’。兩個品種在貯藏早期（15 d）果梗都沒有發現褐變現象，30 d時都有不同程度的褐變發生，到貯藏45 d時，‘瑞都紅玫’果梗褐變程度高于‘瑞都早紅’。綜合5項指標，‘瑞都紅玫’的低溫耐貯性優于‘瑞都早紅’。

2.2 兩個品種葡萄果實中的單萜化合物組分和含量比較

28種游離態單萜和糖苷結合態單萜在兩個品種葡萄果實中均檢測到，含量存在差異（表2、3）。在兩個品種葡萄果實中，游離態單萜含量最高的6個化合物均是里那醇、β-月桂烯、β-cis-羅勒烯、檸檬烯、cis-呋喃型氧化里那醇和香葉醇。除了個別化合物如β-香茅醇、cis-氧化玫瑰和trans-呋喃型氧化里那醇，其余游離態單萜在‘瑞都紅玫’中的含量均高于‘瑞都早紅’（表 2）。游離態單萜總量在‘瑞都紅玫’中也明顯高于‘瑞都早紅’（圖2）。

表1 兩種鮮食葡萄在低溫貯藏過程中表觀品質指標變化Table 1 The changes of fruit appearance quality traits of two grape varieties during storage at (2±1)℃

表2 低溫貯藏過程中兩種鮮食葡萄果實中游離態單萜含量變化Table 2 Changes of free monoterpenes content in two grape varieties during storage at (2±1)℃ (μg·L-1)

續表2 Continued table 2

兩個品種葡萄果實中糖苷結合態單萜含量較高的6個化合物依次是里那醇、β-月桂烯、香葉醇、香葉醛、β-cis-羅勒烯和橙花醚。這些主成分化合物在‘瑞都紅玫’果實中含量高于‘瑞都早紅’，而氧化玫瑰、香茅醇和橙花醇等糖苷結合態單萜的含量在 ‘瑞都早紅’中較高（表3）。但是結合態單萜總量仍表現為‘瑞都紅玫’高于‘瑞都早紅’（圖2）。

關于不同形式單萜含量高低比較，本研究發現在所檢測的28種單萜中，除了里那醇、異松油烯、氧化玫瑰、trans-呋喃型氧化里那醇、4-松油烯醇和香葉酸 6種化合物的糖苷結合態含量在‘瑞都紅玫’果實中低于游離態，其余單萜糖苷結合態含量均高于游離態（表 2、3）。但是總糖苷結合態單萜含量略低于游離態（圖2）；而在‘瑞都早紅’果實中，除了里那醇，其余27種單萜糖苷結合態含量均高于游離態（表 2、3），總糖苷結合態單萜含量高于游離態（圖2）。

表3 低溫貯藏過程中兩種鮮食葡萄果實中糖苷結合態單萜含量變化Table 3 Changes of glycosidically-bound monoterpenes content in two grape varieties during storage at (2±1)℃ (μg·L-1)

續表3 Continued table 3

2.3 低溫貯藏過程中‘瑞都紅玫’果實中單萜化合物變化

在整個低溫貯藏過程中，‘瑞都紅玫’果實中主要游離態單萜成分略有波動。貯藏初期（15 d）變化不大，主要游離態單萜為里那醇、β-月桂烯、β-cis-羅勒烯、cis-呋喃型氧化里那醇、檸檬烯和香葉醇；到貯藏30 d時，‘瑞都紅玫’果實中含量最高的6個化合物依次為里那醇、香葉醇、β-月桂烯、檸檬烯、β-cis-羅勒烯和α-萜品醇；貯藏45 d時，α-萜品醇含量降低而橙花醚含量升高成為主含量單萜。在整個低溫貯藏過程中，里那醇含量均最高。

28種游離態單萜含量在貯藏初期（15 d）均呈現下降趨勢；在貯藏30 d后，包含里那醇在內的大部分單萜含量持續下降，而香葉醇、香葉酸、橙花醇、香葉醛、香茅醛和橙花醛等單萜含量略有上升；貯藏后期（45 d），除了橙花醛，其他27種單萜含量表現上升趨勢（表 2）。聚類分析結果顯示，在低溫貯藏過程中，‘瑞都紅玫’果實中游離態單萜含量變化趨勢主要聚為4類（圖3-A）。第一類包含β-月桂烯（M1）、水芹烯（M3）、(E, Z)-別羅勒烯（M11）、cis-呋喃型氧化里那醇（M12）、trans-呋喃型氧化里那醇（M13）、里那醇（M16）和β-香茅醇（M22），這一類單萜在低溫貯藏過程中含量持續降低，到貯藏30 d時達到最低，貯藏后期略有上升。第二類變化趨勢與第一類相近，不同的是這類化合物在低溫貯藏15 d后含量急劇下降，到貯藏中期（30 d）降至最低，貯藏45 d時含量明顯升高，這類化合物包含檸檬烯（M2）、β-trans-羅勒烯（M4）、γ-松油烯（M5）、β-cis-羅勒烯（M6）、異松油烯（M7）、別羅勒烯（M10）、4-松油烯醇（M17）和α-萜品醇（M20）。第三類有cis-氧化玫瑰（M8）、香茅醛（M15）、橙花醇（M24）、香葉醇（M27）和香葉酸（M28）等單萜，這類單萜在貯藏初期（15 d）含量即降為最低，貯藏中后期含量上升，貯藏45 d時含量明顯升高。第四類僅包含橙花醛（M18），盡管M18在貯藏初期含量也略有下降，但是與前3類不同，該單萜在貯藏30 d時含量最高，貯藏45 d時含量最低。

在低溫貯藏過程中，主要糖苷結合態單萜組分差異不明顯，主要包括里那醇、β-月桂烯、香葉醇、香葉醛和β-cis-羅勒烯等單萜。在貯藏30 d時，β-月桂烯和香葉醇含量升高，高于結合態里那醇含量（表3）。大部分結合態單萜變化趨勢相似，貯藏初期（15 d）表現下降，中期（30 d）又有所上升，貯藏后期（45 d）急劇下降（表 3）。聚類分析顯示結合態單萜在低溫貯藏過程中變化趨勢也主要聚為4類（圖3-B）：第一類有β-月桂烯（CM1）、檸檬烯（CM2）、水芹烯（CM3）、β-trans-羅勒烯（CM4）、γ-松油烯（CM5）、β-cis-羅勒烯（CM6）、別羅勒烯（CM10）、(E, Z)-別羅勒烯（CM11）、香茅醛（CM15）、α-衣蘭油烯（CM19）和γ-香葉醇（CM23），這類糖苷結合態單萜在貯藏15 d時含量顯著下降，之后上升，到貯藏45 d又急劇下降到最低含量。第二類結合態單萜包含異松油烯（CM7）、cis-呋喃型氧化里那醇（CM12）、trans-呋喃型氧化里那醇（CM13）、橙花醚（CM14）、里那醇（CM16）、4-松油烯醇（CM17）和α-萜品醇（CM20），這類單萜在低溫貯藏過程中含量持續降低，沒有明顯的升高過程。第三類結合態單萜在貯藏早期含量降低不明顯，在貯藏30 d時略有上升，到后期（45 d）急劇降到最低，這類單萜包含橙花醛（CM18）、香葉醛（CM21）、β-香茅醇（CM22）、橙花醇（CM24）、cis-異香葉醇（CM25）和香葉醇（M27）。最后一類僅包含香葉酸（CM28），在貯藏15 d時含量升高，之后逐漸降低。

在低溫貯藏過程中，‘瑞都紅玫’果實中游離態單萜總量呈現先下降后期略有升高的趨勢，游離態單萜占總單萜的比例也表現為先下降后期升高的趨勢（圖2）。而糖苷結合態單萜總量在貯藏初期（15 d）下降，貯藏30 d后又升高，之后又略有下降（圖2）。貯藏15 d后，糖苷結合態單萜含量高于游離態單萜含量。

2.4 低溫貯藏過程中‘瑞都早紅’果實中單萜化合物變化

在低溫貯藏過程中，‘瑞都早紅’果實中主要游離態單萜化合物組分改變不大。里那醇含量最高，其次是β-月桂烯，其他化合物含量高低略有變化（表2）。

大多數游離態單萜含量在低溫貯藏過程中呈現下降的趨勢。聚類分析結果顯示（圖 4-A），游離態單萜變化趨勢主要聚為 4類：第一類包含β-月桂烯（M1）、β-cis-羅勒烯（M6）、別羅勒烯（M10）、(E, Z)-別羅勒烯（M11）、里那醇（M16）、α-衣蘭油烯（M19）、香葉醛（M21）、β-香茅醇（M22）、γ-香葉醇（M23）和香葉醇（M27），這類單萜含量在低溫貯藏過程中逐漸降低，到貯藏45 d降到最低。第二類單萜有檸檬烯（M2）、水芹烯（M3）、β-trans-羅勒烯（M4）、γ-松油烯（M5）、異松油烯（M7）、cis-氧化玫瑰（M8）、cis-呋喃型氧化里那醇（M12）、trans-呋喃型氧化里那醇（M13）、香茅醛（M15）、橙花醇（M24）和香葉酸（M28），這類化合物在貯藏早、中期含量上升，貯藏后期急劇下降，降到最低。第三類包含4種單萜trans-氧化玫瑰（M9）、橙花醚（M14）、4-松油烯醇（M17）和α-萜品醇（M20），它們的含量在貯藏15 d或者貯藏30 d顯著升高，之后下降。第四類單萜僅包含橙花醛（M18）一種化合物，該化合物在貯藏15 d含量顯著下降，之后逐漸升高。

在低溫貯藏前期和中期，‘瑞都早紅’果實中主要糖苷結合態單萜組分基本沒有變化，含量最高的化合物是里那醇，其次是β-月桂烯和香葉醇等單萜。到貯藏后期（45 d），里那醇含量下降，β-月桂烯和香葉醇含量升高，分別成為第一、二主含量單萜（表3）。低溫貯藏過程中糖苷結合態單萜含量變化趨勢主要聚為兩大類（圖4-B）：第一類包含β-月桂烯（CM1）、水芹烯（CM3）、β-trans-羅勒烯（CM4）、β-cis-羅勒烯（CM6）、別羅勒烯（CM10）、(E, Z)-別羅勒烯（CM11）、香茅醛（CM15）、γ-香葉醇（CM23）、cis-異香葉醇（CM25）、香葉醇（M27）；橙花醛（CM18）、香葉醛（CM21）、α-衣蘭油烯（CM19）、β-香茅醇（CM22）、橙花醇（CM24）、cis-異香葉醇（CM25）等單萜，這類化合物在貯藏15 d時升高，之后下降，到貯藏45 d含量又有所回升。第二類單萜主要有cis-氧化玫瑰（CM8）、trans-氧化玫瑰（CM9）、里那醇（CM16）、4-松油烯醇（CM17）、α-萜品醇（CM20）、異松油烯（CM7）、cis-呋喃型氧化里那醇（CM12）、trans-呋喃型氧化里那醇（CM13）、橙花醚（CM14）、香葉酸（CM28）、檸檬烯（CM2）、和γ-松油烯（CM5）等，這類糖苷結合態單萜在貯藏前中期含量呈上升趨勢，到貯藏45 d時顯著下降。

在低溫貯藏過程中，‘瑞都早紅’果實中游離態單萜總量表現為逐漸降低的趨勢，到貯藏45 d降到最低，僅為89.26 μg·L-1；糖苷結合態單萜總量在貯藏初期（15 d）升高，貯藏30 d后逐漸降低（圖2）。整個貯藏期間，游離態單萜占總單萜的比例逐漸降低，而糖苷結合態比例上升（圖2）。

2.5 低溫貯藏過程中兩個葡萄品種單萜化合物主成分分析

以不同貯藏時期2個葡萄品種游離態單萜定量數據進行PCA分析（圖5-A），從數據中提取了兩個主成分，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）分別解釋了75.6%和8.6%的變量信息，這兩個主成分占據了所有數據84.2%的變異，反映了化合物的絕大部分信息。在PC1方向，不同貯藏時間樣品可以得到很好地區分，貯藏初期（0 d）和后期（45 d）的‘瑞都紅玫’樣品位于第一象限，貯藏15 d和30 d樣品位于第二象限；而‘瑞都早紅’在貯藏后期（45 d）與其他時期明顯區分開，位于第三象限。除了橙花醛（M18），其他游離態單萜含量與PC1均呈正相關。由圖5-A可見，對于 PC1，香葉酸（M28）、橙花醚（M14）、里那醇（M16）、4-松油烯醇（M17）、cis-呋喃型氧化里那醇（M12）和β-cis-羅勒烯（M6）等單萜載荷值較高，這些化合物在貯藏開始（0 d）和后期（45 d）的‘瑞都紅玫’樣品中含量顯著高于貯藏15 d和30 d的樣品（表2）；在貯藏后期（45 d）‘瑞都早紅’樣品中的含量明顯低于其他3個時期樣品（表2）。這些單萜可以作為區分貯藏時期樣品的主要貢獻差異化合物成分。在PC2方向，兩個葡萄品種明顯區分開，‘瑞都紅玫’樣品位于第一、二象限，而‘瑞都早紅’位于第三、四象限。在PC2中，cis-氧化玫瑰（M8）、橙花醛（M18）和trans-呋喃型氧化里那醇（M13）等游離態單萜載荷絕對值最高，其中M8和M13與PC2呈負相關?！鸲荚缂t’中這兩個單萜含量明顯高于‘瑞都紅玫’，而M18的含量低于‘瑞都紅玫’。這3個游離態單萜可以作為兩個品種區分的主要差異化合物。

以 2個葡萄品種不同貯藏時間糖苷結合態單萜定量數據進行PCA分析（圖5-B），從數據中也提取了兩個主成分，分別解釋了66.6%（PC1）和15.4%（PC2）的變量信息。根據 PC1可以把兩個葡萄品種進行很好的區分，‘瑞都紅玫’樣品位于第二、三象限，而‘瑞都早紅’樣品主要位于第一、四象限。在 PC1中，cis-氧化玫瑰（CM8）、trans-氧化玫瑰（CM9）、trans-異香葉醇（CM26）和β-香茅醇（CM22）等單萜載荷值較大，可以作為品種區分的主要差異物。根據PC2成分，兩個品種不同貯藏時期樣品也可以區分，‘瑞都紅玫’貯藏0 d和30 d樣品位于第二象限，而貯藏15 d和45 d樣品位于第三象限；‘瑞都早紅’貯藏30 d樣品明顯遠離其他時期樣品。在PC2中，trans-異香葉醇（CM26）、γ-香葉醇（CM23）、cis-異香葉醇（CM25）和橙花醛（CM18）可以作為主要差異成分。

3 討論

單萜是葡萄果實中重要的異戊二烯衍生物，是玫瑰香型葡萄的典型香氣成分。研究表明，影響香氣成分積累的因素很多除了采前因素外，采后保鮮貯藏也會引起香氣的變化[6]。本研究發現兩個不同品種果實中，盡管各個單萜含量存在顯著差異，但是主含量化合物成分相似。在‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’果實中，主要高含量游離態單萜有里那醇、β-月桂烯、檸檬烯和香葉醇等化合物，這與孫磊等[19]研究結果一致。這種單萜組分上的相似性可能是因為‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’均是從‘京秀’和‘香妃’雜交后代中選出的優新品種，它們具有相似的遺傳背景[15-16]。此外，‘瑞都紅玫’中游離態單萜含量高于‘瑞都早紅’，孫磊等[19]也在‘瑞都紅玫’中檢測到高于‘瑞都早紅’的單萜含量，感官品嘗‘瑞都紅玫’的玫瑰香味比‘瑞都早紅’更加濃郁。盡管兩者游離態單萜總量遠遠低于玫瑰香型釀酒葡萄被定義的濃度范圍（≥6 mg·L-1）[4]，但這兩個葡萄品種均具有不同程度的玫瑰香味，說明鮮食葡萄可能存在不同的化合物濃度范圍。RUIZ-GARCíA 等[20]的研究表明，葡萄果實玫瑰香味與氧化玫瑰的有無相關，在所有玫瑰香型葡萄品種中都存在氧化玫瑰，而非玫瑰香型葡萄中都不存在氧化玫瑰，本研究在兩個品種中均檢測到不同濃度的游離態氧化玫瑰（表2）。

之前的一些研究表明玫瑰香型葡萄品種富含萜烯類化合物，這些化合物在葡萄果實中主要以糖苷結合態形式存在，這些結合態萜類作為潛在的香味來源具有重要意義[21-22]。本研究首次對兩個品種葡萄果實中糖苷結合態單萜進行了定性定量分析，發現在兩個葡萄品種中大部分糖苷結合態單萜含量明顯高于游離態，說明單萜在這兩種葡萄果實中也主要以結合態形式存在。兩個葡萄品種果實中高含量糖苷結合態單萜組分相似，含有里那醇、β-月桂烯和香葉醇等，這與上述游離態結果相似。FENOLL等[23]在‘玫瑰香’葡萄果實中也檢測到高含量的糖苷結合態里那醇和香葉醇，此外，香茅醇和橙花醇含量也較高，與本研究結果略有不同。成熟的‘陽光玫瑰’果實中也檢測到高含量的里那醇和香葉醇，但是并未檢測到β-月桂烯[24]。此外，之前的研究表明釀酒葡萄果實中糖苷結合態香氣物質含量是游離態的 2—8倍[25]，但是本研究發現在鮮食葡萄果實中存在不同的組成比例，這可能與葡萄品種、果實成熟度和栽培模式等有關。甚至在‘瑞都紅玫’果實中，里那醇、異松油烯和氧化玫瑰等6種單萜游離態含量高于結合態含量，而高含量的游離態單萜更容易被感知，從而增強香味的濃郁程度。WU等[24]在鮮食葡萄‘陽光玫瑰’果實中也檢測到較高含量的游離態異松油烯、氧化玫瑰和脫氫芳樟醇等單萜。

低溫貯藏過程中，‘瑞都紅玫’和‘瑞都早紅’中的大部分游離態單萜或早或晚出現含量降低的趨勢。之前的研究指出低溫貯藏是能夠最大限度保持葡萄果實品質的有效技術，但是隨著貯藏時間的延長，可能會導致果實香味改變或香味喪失[26-27]。貯藏溫度和時間會對揮發性香氣成分產生顯著影響[28-30]。單萜化合物含量之間存在較高的相關性[31]，本研究中同一類化合物變化趨勢相似。β-月桂烯、里那醇和cis-呋喃氧化里那醇等聚為一類；氧化玫瑰、香葉醇和香葉酸等聚為一類；而異油松烯和α-萜品醇等單萜聚在一起，這與釀酒葡萄果實發育過程中各個單萜聚類結果相似[5]，可能與同一類單萜具有相同或者相近的合成代謝途徑相關[3]。但是各個游離態單萜在兩個品種中的變化趨勢不盡相同，如主含量單萜里那醇、β-月桂烯和β-香茅醇（M22）等在兩個品種中雖然都聚在第一類，但在‘瑞都紅玫’中貯藏30 d時含量降為最低，在45 d時含量又有所回升；‘瑞都早紅’則在45 d降為最低。橙花醇（M24）和香葉醇（M27）等化合物在‘瑞都紅玫’中貯藏15 d時含量即降為最低，之后含量又逐漸升高，而在‘瑞都紅玫’中貯藏15 d時含量升高，之后隨著貯藏時間延長而逐漸降低；cis-氧化玫瑰（M8）在兩個品種中也表現不同的變化趨勢，這些差異可能與兩個品種具有不同的低溫耐貯性相關。MORALES等[32]也發現不同品種樹莓在低溫貯藏過程中，里那醇、香葉醇和α-萜品醇等游離態單萜存在相反的變化模式。在不同品種柑橘低溫貯藏過程中，單萜也呈現不同的變化趨勢[33]。28種游離態單萜在兩個品種低溫貯藏過程中的變化有特性也有共性。主成分分析結果顯示兩個品種葡萄中香葉酸（M28）、橙花醚（M14）、里那醇（M16）和4-松油烯醇（M17）等游離態單萜在低溫貯藏過程中含量差異明顯，在PC1中具有高的荷載值，這些游離態單萜可以作為區分不同貯藏時間樣品的主要貢獻單萜成分。

糖苷結合態單萜低溫貯藏過程中的變化模式與游離態單萜表現不同，其中總糖苷結合態單萜的含量和比例與游離態單萜呈現相反的趨勢，這可能是因為在低溫貯藏過程中糖苷結合態和游離態單萜之間發生了相互轉化。MATSUMOTO和IKOMA[14]指出采后貯藏過程中貯藏溫度和時間可能影響萜類化學或酶水解反應，導致各種單萜含量波動差異。糖苷結合態單萜在‘瑞都紅玫’中變化趨勢聚為4類，在‘瑞都早紅’則聚為兩大類。LI等[5]在兩種不同釀酒葡萄中也發現不同的結合態單萜聚類模式，可能與不同品種中單萜糖基轉移酶活性差異有關。隨著低溫貯藏時間延長，包含高含量單萜里那醇、β-月桂烯和香葉醇等各個糖苷結合態單萜呈現不同的變化趨勢，表現出品種特異性。說明相較于貯藏條件，品種對于糖苷結合態單萜影響更大。隨后的主成分分析進一步印證了這一結果，在 PC1方向上兩個品種可以進行很好的區分。RUIZ-GARCíA 等[20]的研究曾指出氧化玫瑰可以作為品種有無玫瑰香味的標記物。本研究也發現在PC1中，糖苷結合態cis-氧化玫瑰和trans-氧化玫瑰都具有較高的荷載值，說明該化合物也可以作為區分兩個品種的主要標記物。

4 結論

‘瑞都紅玫’的低溫耐貯性優于‘瑞都早紅’。兩個鮮食葡萄品種中的主含量單萜化合物組分相近，主要游離態單萜包含有里那醇、β-月桂烯、β-cis-羅勒烯、檸檬烯、cis-呋喃型氧化里那醇和香葉醇等；主要糖苷結合態單萜包括里那醇、β-月桂烯、香葉醇、香葉醛、β-cis-羅勒烯和橙花醚等?！鸲技t玫’中單萜含量高于‘瑞都早紅’。在低溫貯藏過程中，游離態單萜含量呈現動態變化過程，主要呈現4種變化模式；相較于低溫貯藏初期，大部分游離態單萜單萜含量呈現降低趨勢。香葉酸（M28）、橙花醚（M14）、里那醇（M16）和 4-松油烯醇（M17）等游離態單萜可以作為不同貯藏時間樣品區分的主要貢獻單萜成分。在貯藏過程中，總糖苷結合態單萜的含量與游離態單萜呈現相反的趨勢，各個糖苷結合態單萜的變化趨勢因品種而不同。氧化玫瑰可以作為區分兩個品種的主要標記物。