囊胚解凍移植周期中胚胎形態學評分對臨床妊娠結局的影響

王 瑾,呂 睿,陳海霞,穆曉環,白曉紅

(天津醫科大學總醫院婦產科生殖醫學中心,天津市女性生殖健康與優生實驗室,天津 300052;*通訊作者,E-mail:bxhjj@163.com)

隨著輔助生殖技術的進步、冷凍保存技術的改進以及胚胎移植時間的選擇,使得過去近20年來冷凍胚胎移植的使用大大增加[1]。同時,胚胎培養條件的改善使囊胚期的胚胎得到更多的使用[2-4]。目前體外培養為囊胚移植提供了最大的支持,這就為實現健康懷孕和安全分娩的可能提供了技術支持。同時,囊胚移植后的種植率和妊娠率高[5],所以越來越多的中心也優先考慮囊胚移植。另外,胚胎在體外的生長過程中,需要一個統一的標準來評價其發育狀態的好壞,所以目前大部分中心都是利用胚胎/囊胚的形態學來評定胚胎/囊胚是否優質,但是形態學的評分是人為主觀、且只評價觀察當時的胚胎/囊胚的狀態,并不能完全代表胚胎/囊胚的發育潛能。對于獲卵數較多或者第3天(D3)擁有較少形態學高評分胚胎的患者,囊胚培養就非常必要。囊胚培養延長了胚胎的體外培養時間,提供了更長時間自我選擇的機會,使得胚胎能夠充分的發揮發育的潛能[6]。針對D3形態學評分較低的胚胎行囊胚培養后,囊胚形態學評分對解凍移植臨床妊娠結局影響的研究較少。本研究通過分析囊胚解凍移植周期的囊胚及其D3胚胎形態學評分,探討D3形態學評分較低的胚胎形成囊胚的發育潛力及其移植后的臨床妊娠結局,同時為解凍周期的囊胚選擇提供參考依據。

1 資料和方法

1.1 研究對象

回顧性分析自2019年1月至2020年4月在天津醫科大學總醫院婦產科生殖中心解凍移植周期共602個周期和新鮮周期囊胚培養D3高評分111個周期和低評分613個周期。

納入標準:①移植D3優質胚胎的解凍周期;②至少移植1枚囊胚的解凍周期;③D3高評分納入標準:Ⅰ級和Ⅱ級的胚胎;D3低評分納入標準:2PN來源,卵裂球數目4-13個,胚胎碎片≤25%,無多核情況。

本研究根據D3胚胎和囊胚的評分情況進行分組，具體見圖1。D3組為D3優質胚胎組(478例),D3胚胎繼續培養形成的囊胚分為D3形態學評分高組(HD3B組,58例)和形態學評分低組(LD3B組,66例)。再根據囊胚的形態學評分將HD3B組和LD3B組分為H1/L1組優質囊胚組(23/8例),H2/L2組優質+非優質可用囊胚(1 ∶1)組(1/2例),H3/L3組非優質可用囊胚組(34/54例),H4/L4組劣質囊胚組(0/2例)。

本回顧性分析中所有體外操作都是不孕夫婦在接受輔助生殖治療中的常規操作，符合人類輔助生殖技術的規范和要求，且在不孕夫婦知情同意的情況下進行。

圖1 周期分組流程Figure 1 A process of grouping

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎培養方法 本中心的所有胚胎培養液均采用商品化的G-seriesTM培養液(Vitrolife,瑞典)。胚胎培養至D3移植或冷凍后,將剩余養囊胚胎移至G2TM-plus液滴中培養至D5或D6。全部培養過程都置于37 ℃,89%N2、6%CO2和5%O2的三氣培養箱中。

1.2.2 D3胚胎評分標準 本中心根據Peter評分標準[7]對D3胚胎進行評分。Ⅰ級:7-9細胞,卵裂球大小均勻,形狀規則,胞質均勻,無粗顆?，F象,胞質內碎片<10%;Ⅱ級:7-9細胞,卵裂球大小稍有不均,形狀稍有不規則,稍有顆?，F象,碎片10%-15%之間;Ⅲ級:7-9細胞,卵裂球大小明顯有不均,形狀明顯不規則,明顯有顆?，F象,碎片15%-25%之間;Ⅳ級:卵裂球極不均勻,形狀極不規則,胞質極不均勻,顆?，F象嚴重,碎片>25%。本研究將Ⅰ級和Ⅱ級定為評分高的胚胎。

1.2.3 囊胚評分標準 根據Gardner評分標準[8]對囊胚評級。本研究將優質囊胚定義為3級及以上,且內細胞團及滋養層細胞評級都在B級及以上的囊胚;而2級或3級且內細胞團及滋養層細胞有一處評級在C級定義為非優質可用囊胚;2級以下的囊胚為劣質囊胚。

1.2.4 胚胎及囊胚的冷凍與解凍 本實驗室均實行玻璃化冷凍方法進行胚胎及囊胚冷凍。冷凍及解凍的操作均按照日本加藤公司的玻璃化冷凍、解凍套裝說明書進行。

1.2.5 子宮內膜的準備 子宮內膜的準備方案分為:①自然周期;②人工周期;③降調+人工周期。

1.2.6 移植后妊娠結局的判斷 移植后28 d陰道超聲觀察到孕囊判定為臨床妊娠;移植后14 d血液β-hCG的含量>10 IU/ml判定為生化妊娠,含量為≤10 IU/ml判定為未妊娠。

1.3 觀察指標及判定標準

總結分析女性患者一般臨床資料、助孕指標及囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率、非優質可用囊胚率、解凍存活率、解凍完整率、種植率、臨床妊娠率、生化妊娠率和流產率。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 新鮮周期D3胚胎囊胚形成情況

新鮮周期將挑選D3胚胎冷凍或新鮮移植后的不同評分胚胎進行囊胚培養。統計本中心的囊胚培養情況,共395枚D3形態學高評分的胚胎進行囊胚培養,囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率、非優質囊胚形成率和劣質囊胚形成率分別為60.51%(239/395),49.11%(194/395),19.25%(46/239),61.92%(148/239)和18.83%(45/239);D3低評分胚胎2 415枚進行囊胚培養,囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率、非優質囊胚形成率和劣質囊胚形成率分別為14.74%(356/2 415),12.7%(307/2 415),8.99%(32/356),77.25%(275/356)和13.76%(49/356)。兩組的囊胚形成率、可利用囊胚形成率、優質囊胚形成率和非優質囊胚形成率差異均有統計學意義(P<0.001或P<0.05),劣質囊胚形成率差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。

表1 新鮮周期D3胚胎囊胚形成情況

2.2 解凍移植周期各組患者一般臨床資料情況比較

在解凍移植周期中,移植D3優質胚胎的D3組,移植上述新鮮周期D3不同評分形成囊胚的HD3B組和LD3B組,將三組患者的女方年齡、女方不孕年限、女方的不孕類型以及解凍移植周期的內膜準備方案、移植日的內膜類型和內膜厚度進行比較,統計數據發現,在上述方面,除在年齡方面差異有統計學意義(P<0.05),其余方面差異均無統計學意義(P>0.05,見表2)。

2.3 解凍移植周期三組臨床妊娠結局情況比較

三組間解凍存活率和解凍完整率比較差異均無統計學意義(P>0.05),但HD3B組和LD3B組平均移植胚胎數D3組差異有統計學意義(P<0.001)。HD3B組和LD3B組移植的囊胚質量差異有統計學意義(P<0.01);三組間種植率差異有統計學意義,HD3B組和LD3B組種植率高于D3組(P<0.001或P<0.01),而HD3B組與LD3B組間比較差異無統計學意義(P>0.05);HD3B組臨床妊娠率高于D3組(P<0.05),而LD3B組與其他兩組比較差異無統計學意義(P>0.05);三組間流產率、生化妊娠率差異無統計學意義(P>0.05,見表3)。

表2 解凍移植周期三組患者基本情況的比較

表3 解凍移植周期三組胚胎妊娠情況比較

HD3B組和LD3B組中評分同等級的囊胚移植后臨床妊娠結局的比較H1組和L1組種植率和妊娠率分別比較,差異無統計學意義(P>0.05);H2組和L2組、H4組和L4組由于組中存在0個周期,所以不做統計學比較;H3組和L3組間種植率、妊娠率和流產率分別比較,差異無統計學意義(P>0.05,見表4)。

表4 相同質量來源不同的囊胚解凍移植的臨床妊娠結局比較

3 討論

3.1 結果分析

新鮮周期中,形態學評分低的D3胚胎有一定形成囊胚的能力,并且形成非優質可用囊胚的比例較高,說明D3胚胎形態級別雖然低,但是仍然有一部分胚胎具有發育的潛力。

在囊胚解凍移植周期中,D3高評分胚胎形成的優質囊胚移植比例較高,而D3低評分胚胎形成的非優質可用囊胚移植比例較高,這與新鮮周期D3低評分胚胎形成非優質可用囊胚比例較高有關系。分析對比三組的基本臨床信息,發現患者的年齡在三組中差異有統計學意義(P<0.05);平均移植胚胎數在三組間差異有統計學意義(P<0.001),這是因為囊胚每次移植數通?？刂圃?枚,而D3優質胚胎移植2枚的周期較多。三組間種植率差異有統計學意義(P<0.001),移植的囊胚組優于D3優質胚胎組,但囊胚組兩組間差異無統計學意義(P=0.324);造成這個結果的原因,其一可能是D3高評分胚胎形成的囊胚組的患者年齡偏低;其二是囊胚本身的種植率優于D3優質胚胎,所以D3低評分胚胎形成的囊胚依然有較高的種植率。三組間臨床妊娠率比較,差異有統計學意義(P=0.039),D3高評分胚胎形成的囊胚組高于D3優質胚胎組(P=0.024),D3低評分胚胎形成的囊胚組高于D3優質胚胎組(P=0.150)但低于D3高評分胚胎形成的囊胚組(P=0.480)。三組間流產率和生化妊娠率比較,差異無統計學意義(P>0.05)?？偨Y上述結果一方面證明解凍移植周期中,D3低評分胚胎形成的囊胚有很好的利用價值,有較高的種植率和妊娠率;另一方面,當患者解凍移植周期有對應上述三組胚胎/囊胚供選擇時,D3高評分胚胎形成的囊胚最優,D3低評分胚胎形成的囊胚其次,最后選擇移植D3優質胚胎。

對于解凍移植囊胚時,囊胚評分級別相同、D3評分不同的囊胚妊娠結局對比,種植率、臨床妊娠率和流產率差異無統計學意義(P>0.05)。目前數據分析發現,囊胚期的評分級別相同,解凍移植周期的臨床妊娠結局也是相似的。但是周期數較少,若要得出上述結論還需更多周期數據的支持?？傊?D3低評分的胚胎形成的囊胚在不增加流產率的同時能夠獲得較好的種植率和妊娠率。進一步說明了D3低評分的胚胎形成的囊胚仍有較好的利用價值。

3.2 D3低評分的胚胎形成囊胚后解凍移植的意義

目前大部分中心都是利用胚胎的形態學來評定胚胎是否優質,D3胚胎在評定之后,新鮮周期選擇冷凍或者移植;而剩余的評分低胚胎會選擇繼續體外培養,并且在許多文章中都報道獲得了較好臨床妊娠結局[9-13]。首先,胚胎在體外培養至囊胚期時,會將一些發育潛力弱,染色體異常的胚胎淘汰;其次,囊胚是胚胎發育的高級階段,在自然生理狀態下,胚胎早期在輸卵管發育,當發育至囊胚階段時移動到子宮腔內,所以囊胚期的胚胎與子宮內膜更同步,增加了囊胚移植的種植率和妊娠率[14]。

本研究通過對比D3不同評分胚胎形成囊胚的情況,發現評分低的胚胎仍有一定形成囊胚的能力,并且種植率和妊娠率都高于解凍移植D3高評分胚胎的周期。另外,D3不同評分胚胎形成的囊胚,在解凍移植后有較好的妊娠率和較低的流產率。表明了D3低評分的胚胎具有一定的發育潛能,所以囊胚培養保證了新鮮周期所有胚胎的充分利用;在解凍移植周期同時存在D3優質胚胎和囊胚的情況下,低評分的胚胎形成的囊胚可以優于D3優質胚胎使用。