毛木耳優良雜交菌株的選育*

姚方杰，孫文娟，魯麗鑫，王 鵬，陸 甲，張友民**

（1.吉林農業大學園藝學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學食用菌新種質資源創制國際聯合研究中心，吉林 長春 130118；3.吉林省農業科學院經濟植物研究所，吉林 公主嶺 136105）

毛木耳（Auricularia cornea Ehrenb.），是擔子菌門 （Basidiomycota） 蘑菇綱 （Agaricomycetes） 木耳目 （Auriculariales） 木耳科 （Auriculariaceae） 木耳屬（Auricularia） 的一種膠質真菌[1]。毛木耳在我國17個省市（直轄市、自治區）均有栽培，其口感脆滑，素有“樹上海蜇皮”之美稱，是一種營養豐富，保健功能強大的天然食（藥） 用菌[2-3]。

根據中國食用菌協會統計，2017年我國毛木耳總產量約為168.64萬噸，為我國第六大食用菌[4]。毛木耳生產周期較短，生物學效率高，栽培技術簡單且生產經濟效益高，因此已經成為很多貧困地區脫貧致富的首要選擇項目之一[5]。伴隨著產業規模逐步的加大，市場上出現隨便引種、品種退化、產量降低等諸多問題[6]，同時市場呈現多元化，消費者對于毛木耳的需求逐年增加，對毛木耳的口感、色澤、品質等要求趨于多樣。目前市場上毛木耳優良品種匱乏，極大地阻礙了毛木耳產業的發展，因此加強優良品種選育是毛木耳產業健康發展的重要內容[4]。為此開展毛木耳顏色與商品性狀的遺傳研究和優良雜交品種選育，為進一步的遺傳育種提供科學依據，為生產提供優良品種。

1 材料與方法

1.1 親本菌株

親本一為栽培毛木耳菌株ZP，淺褐色，耳片大，扁圓形；親本二為野生毛木耳菌株YZ，白褐色，耳片小，近圓形。菌種均保存于吉林農業大學園藝學院。對照品種（CK） 為海南省當地栽培品種，與栽培菌株ZP相比，子實體較小，顏色較深。

1.2 雜交菌株制備

2個親本菌株的成熟耳片制備孢子印→單孢分離→單核菌株→單單雜交→雜交菌株，具體方法參照參考文獻[7]。

1.2.1 孢子的收集與分離

選擇毛木耳成熟的耳片，用75%的酒精擦拭子實體表面，再用無菌水沖凈，后用無菌濾紙吸取多余水分，將其腹面朝下置于無菌的培養皿中，12 h后培養皿底部可見1層白色的孢子印，取出子實體，封口培養皿待用[8]。

在超凈工作臺中，加入無菌水200 μL至收集到的含有孢子印的培養皿中，制成孢子懸濁液，用血球計數板計數后用無菌水稀釋至濃度為100個/mL，用移液槍吸取200 μL的孢子懸濁液至平板培養基并用無菌的涂布器涂抹均勻，封口后置于25℃培養箱中培養。每天觀察孢子的萌發情況，當培養基上出現星芒狀小菌落時，及時分離小菌落并挑取轉接至斜面培養基中，進行編號命名后置于25℃培養箱中培養。

1.2.2 單核菌絲的鑒定

分別配置質量分數為10%的KOH溶液和1%剛果紅溶液，并各加入1滴在載玻片上，挑取培養后的單菌落置于溶液中并蓋上蓋玻片。將制好的玻片置于光學顯微鏡（物鏡40倍，目鏡10倍）中觀察菌絲有無鎖狀聯合，無鎖狀聯合的菌株為單核菌株[8]。

1.2.3 雜交組合的制備

分別將兩親本菌株的單核菌絲接入到同一平板培養基中，菌塊相距約1 cm，25℃進行培養。待2個菌株的菌絲充分接觸后，挑取中間部位至斜面培養基中，并編號命名，置于25℃培養箱中培養。

1.2.4 雜交菌株的鑒定

雙核菌株的鑒定參考1.2.2，從有鎖狀聯合的菌株中選擇菌株ZP的1個單核菌株與菌株YS的3個單核菌株分別雜交，菌株ZP的3個單核菌株與菌株YS的1個單核菌株分別雜交，共形成5個雜交菌株（ZP-1×YS-1，ZP-1×YS-8，ZP-1×YS-17，ZP-2×YS-17，ZP-6×YS-17）。將雜交菌株與兩親本接入到同一平板培養基中，兩兩菌塊相距約2 cm，呈品字排列，25℃培養箱中培養。觀察雜交菌株與親本是有無明顯的拮抗線，淘汰與親本沒有拮抗線的菌株。再將雜交菌株之間對峙培養，觀察雜交菌株之間有無明顯的拮抗線，若無拮抗線，將其中生長勢較弱的菌株淘汰[9]。

1.3 商品性狀遺傳分析

從雜交菌株中選出5個雜交菌株（ZP的1個單核菌株與菌株YS的3個單核菌株分別雜交，菌株ZP的3個單核菌株與菌株YS的1個單核菌株分別雜交），將其與兩親本同時開展進行出耳試驗，調查商品性狀（顏色、耳片形狀、大?。?，用于遺傳分析。

1.4 生產試驗

將5個雜交菌株和對照品種同時在海南進行生產試驗，常規管理。培養料配方為菌草15.0%、木屑 62.0%、麥麩 20.0%、石灰 1.5%、石膏 1.5%，含水量58%～60%。調查生育期、產量具體方法按參照參考文獻[10]。

2 結果與分析

2.1 雜交組合的制備與真實性鑒定

將收集的親本菌株ZP和親本菌株YS的孢子印分離并培養，菌株經過鏡檢獲得單核菌株。選擇長勢較好的單核菌株進行單單雜交，共制備了100個雜交子。通過鏡檢確定這些雜交組合均具有鎖狀聯合，為真實雜交菌株。5個雜交菌株與兩親本進行兩兩拮抗試驗，結果如表1所示。

表1 雜交菌株的拮抗反應Tab.1 The antagonistic reaction among Auricularia cornea hybrids

從表1可以看出，雜交菌株與親本之間均產生拮抗，各雜交菌株之間均產生拮抗現象，說明雜交菌株與兩親本以及雜交群體之間均為生理特性不同菌株。

表2 雜交菌株與親本的商品性狀Tab.2 Commercial character of Auricularia cornea hybrids

2.2 商品性狀遺傳

雜交菌株與親本的商品性狀統計見表2。

如表2所示，親本菌株ZP的1個單核菌株與另一親本菌株YS的不同單核菌株進行雜交，親本菌株ZP的3個單核菌株與另一親本菌株YS的1個單核菌株進行雜交，雜交菌株商品性狀差異明顯。兩親本雜交出來的F1菌株顏色均比親本顏色深，表現為超親遺傳，其中菌株ZY1、ZY3、ZY4為深褐色，菌株ZY2、ZY5為褐色。耳片厚度表現為超親遺傳，由大到小依次為ZY5>ZY4>CK>ZY1>ZY2>ZY3=ZP>YS。耳片長寬比更小，呈扁寬圓形，雜交菌株的耳片長度除ZY1菌株在兩親本之間，其他菌株均小于兩親本，長度由大到小依次為ZP>ZY1>YS>ZY3>ZY2>ZY5>CK>ZY4，雜交菌株的耳片寬度均在親本之間，未出現超親現象。寬度由大到小依次為ZP>ZY1>ZY5>ZY3>CK>ZY2>ZY4>YS。

2.3 海南省生產試驗

在海南省開展雜交菌株的生產試驗統計結果，見圖1。

生產試驗發現雜交菌株與對照品種在生育期方面相似，而產量和泡發度方面相差較大，如圖1所示，5個雜交菌株均適宜在海南省栽培，產量均超過對照品種，其中菌株ZP的1個單核菌株與菌株YS的3個單核菌株的雜交子ZY3、ZY1、ZY2分別比對照增產92.75%、75.36%、28.98%，說明菌株YS的3個單核菌株的產量特性方面YS-17>YS-1>YS-2；親本菌株ZP的3個單核菌株與另一親本菌株YS的一個單核菌株（YS-17） 的雜交子 ZY5、ZY3、ZY4，分別比對照增產 113.04%、92.75%、62.22%，說明菌株ZP的3個單核菌株的產量特性方面ZP-6>ZP-1>ZP-2，所以單核菌株YS-17與菌株ZP-6雜交而成的菌株ZY5的產量最高，高于對照品種113.04%。雜交菌株泡發度方面除了菌株ZY4小于對照，其余菌株均高于對照，其中ZY3>ZY1>ZY2，即在泡發度特性方面單核菌株YS-17>YS-1>YS-2；而由同一單核菌株YS-17與其他單核菌株雜交的菌株在泡發度方面ZY3>ZY5>ZY4，即菌株ZP的單核菌株在泡發度特性方面ZP-1>ZP-6>ZP-2，所以泡發度方面最高的是單核菌株YS-17與單核菌株ZP-1雜交而成的菌株ZP3，比對照品種高29.47%。

3 討論

本試驗中，顏色較淺的2個親本菌株能雜交出深色品種，再次說明無論顏色多么淺，都屬于有色類型，這與本團隊關于毛木耳顏色遺傳的報道結果相似[11]。

本研究的生產試驗地點為海南省，在選擇對照品種時，選擇的為當地的主栽品種而不是雜交菌株的親本是因為這樣能夠更好的體現雜交菌株在海南省的實際生產情況。當地食用菌產業起步晚、規模較小，很多品種也是由外地引入[12]。試驗獲得的雜交菌株比海南當地品種增產效果明顯，可能是這些雜交品種確實優良，也可能因為當地引入的毛木耳品種尚不適應在海南栽培造成的。

雜交育種通常選擇兩親本各10個單核菌株進行兩兩配對雜交[8]，這樣選擇的單核菌株較少且雜交配對組合較多，不能全面的選擇最優的單核菌株。本試驗在進行雜交時選擇A菌株的1個單核菌株與B菌株的多個單核菌株分別雜交，篩選出B菌株的最優單核菌株，同時選擇A菌株的多個單核菌株與B菌株的一個單核菌株分別雜交，篩選出A菌株的最優單核菌株，然后用A菌株的最優單核菌株與B菌株的最優單核菌絲進行雜交得到最優的雜交菌株[13]。該方法可以最大可能的篩選出優良組合，同時節省了雜交的時間，為食用菌雜交技術提供一個優質的方法。

耳片顏色、形狀和大小是毛木耳重要的商品性狀[14]，本文研究結果為毛木耳雜交育種提供了參考。同時，今后還要增加菌株數量，調查更多指標，進一步完善雜交菌株顏色遺傳規律的探究。