海藻糖和甘油相互協同提高絨山羊精液冷凍保存品質

宋國欣，張家新,2*，王瑞軍,3，張美娜，李金泉,2,3*

（1.內蒙古自治區動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.農業農村部肉羊遺傳育種重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018；3.內蒙古自治區山羊遺傳育種工程技術研究中心，內蒙古呼和浩特 010018）

海藻糖作為非滲透性二糖，其作用原理是通過增加稀釋液的表面張力以及穩定質膜來保護細胞，這是由于海藻糖可以與細胞膜磷脂的磷脂極性頭基直接相互作用[1]。海藻糖通過自身抗氧化作用清除冷凍過程產生的活性氧（ROS），減少脂質過氧化反應（LPO），提高精子冷凍保存效果[2]。海藻糖對精子的保護作用可能優于其他糖類（葡萄糖、蔗糖），目前已在牛[3]、山羊[4]、綿羊[5]、貓[6]、豬[7]等多個物種上證明了海藻糖的積極作用。

甘油作為滲透性冷凍保護劑，它通過滲透到細胞內插入脂質雙分子層，改變細胞質粘度、改變水分子的擴散速率、抑制冰晶形成等方式穩定細胞結構[8]。海藻糖和甘油兩者共同作用可以防止冰晶形成，穩定精子膜的脂質和蛋白質，增加精子冷凍時的脫水速度以及膜流動性[9]。因此在精子冷凍過程中聯合補充海藻糖和甘油的作用效果優于單獨添加某一種冷凍保護劑。

盡管可以預期甘油和海藻糖之間的協同作用會提高精子冷凍保存效果，但兩者特性不同，對精子的保護方式存在差異[10]。因此，本研究旨在檢驗冷凍稀釋中不同濃度海藻糖和甘油對精子冷凍解凍后的綜合參數，探究海藻糖和甘油協同作用對絨山羊精子冷凍保存的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Tris、檸檬酸、葡萄糖、海藻糖、甘油均購于Sigma 公司，雙抗購于Gibco 公司，AnnaxinV/PI 試劑盒購于BD 生物技術公司，PNA-TITC 購于上海哈靈生物技術公司，吖啶橙（A8120）、SOD（NAT 法）檢測試劑盒、DCFH-DA（S0033）和Fluo-3AM 檢測試劑盒均購于碧云天生物技術公司，MAT 脂質過氧化試劑盒購于北京索萊寶生物有限公司。

1.2 精液采集 精液采自6 只（1.5～2 歲）健康且具有正常繁殖性能的內蒙古絨山羊種公羊。利用假陰道法采集精液并進行鮮精品質檢測和冷凍前處理工作。用于精液冷凍保存精液應達以下標準：精液射精量在1～2 mL，最低密度2×109個/mL，精子活力在80% 以上。為消除個體差異，將精液在37℃下進行混合。

1.3 冷凍稀釋液配制 本實驗使用的基礎稀釋液為300 mmol/L Tris，95 mmol/L 檸檬酸－水合物、56 mmol/L葡萄糖、1% 雙抗（v/v）、10% 卵黃（v/v）。根據實驗設計在基礎稀釋液上添加不同濃度的海藻糖0 mmol/L（T0）、50 mmol/L（T50）（海藻糖濃度為實驗前自行篩選得到最適濃度），以及0%（G0）、1%（G1）、2%（G2）、3%（G3）的甘油。將配制好的稀釋液用0.22 μm濾器過濾混勻，4℃備用。

1.4 精液冷凍 將混合后鮮精分為8 等份，分別與含有不同濃度甘油和海藻糖的稀釋液以1:5 的稀釋倍數進行稀釋。將混合后精液置于4℃冰箱內，以0.2℃/min 緩慢降溫至4℃后裝入0.25 mL 冷凍細管，封管后繼續平衡30 min。平衡后冷凍細管放置在自制熏蒸架上，置于距液氮4 cm 處熏蒸7 min，投入液氮中冷凍保存。冷凍保存1 周后進行解凍，解凍時，將冷凍細管投入38℃水浴中30 s[11]。

1.5 精子質量檢測

1.5.1 精子運動檢測 取10 μL 解凍后精子于精子分析儀專用載玻片上，利用精子分析儀輔助分析系統（Computer-Assisted Sperm Analysis System-CASA，日本）分別檢測解凍后精子活力和精子運動速率，其中精子運動速率包括直線運動速率（VSL）、曲線運動速率（VCL）以及平均路徑速度（VAP）。

1.5.2 精子結構檢測 將解凍后的精液，加入適量PBS，1 000 r/min 離心3 min 進行洗滌，棄上清后利用PBS 重懸，調整精子密度為1.2×107。按照PNA-FITC試劑盒說明操作染色30 min 后洗滌，加入10 μL PI 染色5 min，洗滌，最終利用流式細胞儀進行精子頂體完整率檢測。流式細胞儀（ACEA Novo Cyte TM）檢測時，設置參數采集2 萬個精子細胞。PNA-FITC/PI 染色后，統計Q2-3（PI-PNA-），為完整頂體的精子比率。在上述精子密度下，按照Annaxin V/PI 試劑盒說明對精子進行染色檢測精子膜的完整性，染色20 min 后利用PBS 洗滌，上流式細胞儀進行檢測分析。流式細胞儀檢測2 萬個精子細胞數，Annaxin V/PI 染色后，統計Q2-3（PI-Annexin -V-）為完整質膜的精子比率。在上述精子密度下，利用DNA 凋亡檢測試劑盒進行操作，10 μmol/L 吖啶橙染液避光染色15 min。染色后，流式細胞儀分析精子DNA 完整比率。

1.6 精子中總超氧化物歧化酶和丙二醛含量檢測 冰浴預冷后的PBS 對解凍后精子進行洗滌，沉淀的精子細胞冰浴勻漿后4℃離心，取上清備用。利用總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒進行檢測，按照說明書要求配制檢測液，按說明書將檢測液和樣品加到96 孔板，孵育5～10 min。隨后用酶標儀在560 nm 下檢測吸光值，每個樣品設置3 組空白對照，利用總SOD 含量公式進行計算。樣品總SOD 含量=[（A空白對照1-A空白對照2）-（A樣品-A空白對照3）]/（A空白對照1-A空白對照2）。

丙二醛（MDA）含量檢測：將解凍后精液利用PBS 洗滌后去上清，加入MDA 提取裂解液，冰浴超聲破碎后，12 000 r/min 離心10 min，取上清。利用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度，用酶標儀繪制標準曲線，利用標準曲線計算蛋白濃度,以下蛋白濃度用Cpr 表示。按照說明書要求對MDA 含量進行測定，將待測樣品與MDA 檢測工作液混勻；將混合液99℃水浴保溫30 min 后冰浴冷卻，10 000 r/min 離心10 min，吸取上清，多功能酶標儀測定A450、A532、A600 的吸光值。MDA（nmol/mg prot）=5×[12.9×（A532-A600）-2.58×A450]/ Cpr。

1.7 精子中ROS 和Ca2+水平檢測 將解凍后的精液加入適量PBS 洗滌，1 000 r/min 離心3 min，棄上清，調整精子密度為1.2×107/mL。用ROS 檢測試劑盒檢測ROS 水平，洗滌后的精子加入1 mL 不含卵黃和甘油的稀釋液，加入10 μmol/L DCFH-DA，37℃，5% CO2培養箱避光孵育30 min，每隔5 min 輕輕顛倒混勻后PBS洗滌3 次后重懸，取200 μL 待測液進行流式細胞儀檢測其熒光值，熒光強度=熒光值A（DCFH-DA）-熒光值B（細胞自發光）。

檢測精子細胞中游離的Ca2+水平，洗滌后的精子加入PBS 懸浮調整濃度為1.2×107/mL，加入5 μmol/L Fluo-3AM，37℃，5% CO2 培養箱避光孵育60 min，離心去上清，加入PBS 懸浮繼續孵育30 min，洗滌2 次，PBS 重懸，取200 μL 用流式細胞儀檢測其熒光值，其中,熒光強度=熒光值A（Fluo-3AM）-熒光值B（細胞自發光）。

1.8 統計分析 采用SAS9.0 軟件進行存在交互作用雙因素方差分析和顯著性檢驗。數據用平均值±標準差表示。用P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 海藻糖甘油協同作用對精子冷凍-解凍后運動性能的影響 如圖1 所示，T50G1 組精子活力顯著高于其他各組，T0G0 組和T50G0 組的精子活力顯著低于其他各組。存在甘油時，T0 組，解凍后精子活力隨著甘油濃度的升高而升高；而T50 組，解凍后精子活力隨著所添加甘油濃度的升高而降低（圖1-A）。在速率檢測中，T50G1 組的VCL、VSL、VAP 均顯著高于其他各組，而T0G0 組和T50G0 組的VCL、VSL 和VAP 顯著低于其他各組。T50G2、T50G3、T0G3 組VCL 水平差異不顯著（圖1-B）。

圖1 絨山羊精子解凍后活力（A）和速率（B）

2.2 海藻糖甘油協同作用對絨山羊精子冷凍-解凍后DNA 完整率、頂體完整率和質膜完整率的影響 由圖2 可知，T50G1 和T50G2 組DNA 完整率顯著高于其他各組且兩組之間差異不顯著。T0G0 組和T50G0 組DNA完整率顯著低于其他各組，DNA 完整率在70%左右。T50G1 組頂體以及質膜完整率顯著高于其他各組，T0G0組顯著低于其他各組。存在甘油時，T0 組解凍后精子完整質膜比率隨著甘油濃度的升高而升高；T50 組，解凍后精子質膜完整率隨著所添加甘油濃度的升高而降低。

2.3 海藻糖甘油協同作用對絨山羊精子中SOD 和MDA含量的影響 如圖3-A 所示，T50G1 組和T50G2 組冷凍-解凍后精子細胞中總SOD 水平顯著高于其他各組，T0G0 組顯著低于其他各組。如圖3-B 所示，T0G0 組精子中MDA 含量顯著高于其他各組，T50G1、T50G2、T50G3 組顯著低于其他各組，但這3 組之間差異不顯著。

2.4 海藻糖甘油協同作用對絨山羊精子中ROS 和Ca2+水平的影響 利用DCFH-DA 對解凍后絨山羊精子中ROS 進行特異性染色后，利用流式細胞儀對其熒光強度進行檢測分析，其中檢測到的熒光強度越高證明精子中ROS 水平越高。如圖4-A 可知，T0G0 組ROS 水平極顯著高于其他各組，T50G1 組和T50G2 組極顯著低于其他各組，但兩組之間差異不顯著。Fluo 3-AM 對冷凍-解凍后Ca2+進行特異性染色，其中熒光強度越高，精子中Ca2+水平越高。如圖4-B 所示，T0G0 組熒光強度極顯著高于其他各組，T50G1 組極顯著低于其他各組，T50G1 組極顯著低于其他各組。

3 討 論

凍融過程對精子細胞的結構和功能造成損害，導致冰晶形成、滲透失衡、氧化應激使精子活力以及受精能力下降[12]。研究表明，可以通過向冷凍稀釋液中添加某些可以減少冰晶形成、維持滲透平衡以及抵御氧化應激的物質提高精子冷凍保存效果[13]。

海藻糖是精子冷凍保存中常用的冷凍保護劑，同時海藻糖還具有一定的抗氧化能力，對山羊精子冷凍保存起到積極作用[14]。本研究結果顯示，添加50 mmol/L 海藻糖更有利于精子保存，提高精子活力，維持精子結構完整性。并且海藻糖可以通過提高SOD 含量、降低MDA 水平、降低Ca2+內流、減少 ROS產生，從而提高精子抗氧化能力，提高解凍后精子品質。Aisen 等[15]和Bispo 等[16]在山羊精子冷凍保存研究中，將精子保存于添加100 mmol/L 海藻糖的冷凍稀釋液中，冷凍-解凍后精子活力以及結構完整性顯著高于其他組別。Zhu 等[2]研究證明，在兔精液冷凍保存過程中添加100 mmol/L 海藻糖可以通過提高精子中SOD 含量、降低ROS 水平進而提高精子活力和品質，其中海藻糖添加量的不同可能是冷凍方式或者物種不同所導致，但與本研究結果相同，這說明海藻糖在維持冷凍-解凍后山羊精子的活力、速率和細胞結構完整性以及提高精子抗氧化能力具有重要作用。

圖2 冷凍解凍后精子的頂體完整性、質膜完整性和DNA 完整性分析

甘油作為山羊精液冷凍保存常用滲透性冷凍保護劑，添加量一般在3%～5%，高濃度甘油對精子具有毒害作用[17]。在常溫下，甘油會損傷精子頂體和頸部，造成尾部彎曲，破壞某些酶類，從而影響受精率[18]，并導致精子細胞骨架中肌動蛋白絲的解聚[19]。生產和實驗中為防止甘油對精子的毒性作用，通常利用非滲透性冷凍保護劑（如蔗糖和海藻糖）代替甘油或者減少甘油添加量，以改善解凍后精子質量[20]。本實驗結果顯示，添加50 mmol/L 海藻糖時，1%甘油可以在保護精子的同時可對精子的毒性降到最低。這一結果與Athurupana 等[20]研究結果接近，即利用100 mmol/L 海藻糖完全替代甘油，可提高豬精子冷凍保存效果。但在本研究中，海藻糖不能夠完全替代甘油，這可能是由于山羊和豬精子質膜組成不同。

圖3 解凍后精子總SOD 及MDA 含量

圖4 DCFH-DA 和Fluo 3-AM 熒光強度分析

本研究中，海藻糖和甘油聯合使用的效果顯著優于單獨添加海藻糖或者單獨添加甘油，證明兩者之間通過相互協同的方式發揮作用。T50G1 組活力顯著高于其他各組，50 mmol/L 海藻糖和1%甘油聯合作用時解凍后精子活力最高，在70% 左右。除此之外，海藻糖和甘油的協同作用對精子活力和膜完整性具有一定的濃度依賴性。存在甘油時，添加海藻糖組精子活力和質膜完整性隨著甘油濃度的升高而降低，T50G1 高于T50G3 組。而未添加海藻糖組恰恰相反，精子活力和質膜完整性隨著甘油濃度的升高而降低，T0G1 組低于T0G3 組。但在精子的頂體完整率和抗氧化性能等其他指標上并不存在這一規律。

目前，海藻糖和甘油互作機制尚未明確，但可以通過現有的研究及結果進行推測。海藻糖和甘油對精子的保護方式上存在差異，兩者可能是通過互補的方式協同保護精子質膜完整性，從而提高精子活力[21]。本實驗可以證實這一假設，海藻糖和甘油聯合互作會顯著提高精子活力、膜完整性等相關指標，其作用結果顯著優于不添加海藻糖或甘油的各組。海藻糖和甘油對精子膜完整性的作用存在一定規律，主要可能因為當僅存在甘油時，精子只能依賴甘油來抵御冷凍損傷，較高濃度的甘油更容易發揮保護作用，提高精子活力；而當存在海藻糖時，海藻糖和甘油共同抵御冷凍損傷，所需甘油濃度下降，高濃度甘油反而會損傷精子質膜，降低精子活力。

海藻糖和甘油通過協同作用提高絨山羊精子冷凍保存質量，這一結果與Najafi 等[22]基于大豆卵磷脂（SL）稀釋液上聯合添加海藻糖和甘油對山羊精子的影響結果一致。海藻糖發揮非滲透保護作用，甘油發揮滲透性冷凍保護作用，兩者通過彼此互補發揮自身優勢，充分保護精子膜完整，提高膜流動性從而提高精子活力和品質。同時海藻糖具有抗氧化作用，通過增加SOD 含量、降低 ROS 水平等方式提高精子抗氧化能力，提高精子冷凍保存效果[23]。

4 結 論

本研究結果表明，在絨山羊精液冷凍保存過程中，海藻糖和甘油通過濃度相互協同作用提高精子冷凍保存效果。其中當海藻糖濃度為50 mmol/L、甘油濃度為1%時，取得最佳的精子冷凍保存效果。