薔薇科植物果實花青苷積累研究進展

盧雯瑩 趙磊 李天奇 崔鶴云 廖平安

（1. 漯河市農業科學院，漯河 462000；2. 中國科學院武漢植物園，武漢 430074；3. 漯河市農業農村局，漯河 462000）

薔薇科植物是自然界的重要組成部分，世界上許多水果，如蘋果、梨、草莓和桃等均屬于薔薇科植物。薔薇科果實因富含花青苷而具有豐富多彩的顏色?；ㄇ嘬兆鳛橐环N重要的抗氧化酚類化合物，具有預防心血管疾病、抗炎抗癌活性，是重要的保健物質［1］。近年來，消費者對水果保健功能的要求越來越高，如何提高水果的花青苷含量是果樹學家長期研究的課題。

不同于糖酸代謝，花青苷是植物體內重要的次生代謝產物，代謝起始物質為葡萄糖分解產生的苯丙氨酸?；ㄇ嘬盏纳锖铣赏緩揭咽智逦?，研究表明，光照和溫度等外界環境、乙烯和茉莉酸等激素水平均能調節花青苷代謝，從而影響果實的花青苷含量。隨著分子生物學技術水平的提高，科學家們對花青苷積累的的分子機理進行了探索，這些機理將為提高薔薇科果實花青苷含量奠定堅實的理論基礎。為此，本文對近些年來有關薔薇科果實花青苷積累的分子調控機理研究進行了綜述。

1 花青苷生物合成及轉運途徑

植物之所以顯示顏色，主要是富含葉綠素、類胡蘿卜素、甜菜素和黃酮類等物質，花青苷作為黃酮類的重要組成，對園藝作物果實色澤有著重要的影響［2-3］。20世紀初，Weldon［4］對孟德爾關于豌豆著色的研究進行了總結，自此，花青苷生物合成途徑被不斷完善?；谇叭藢τ衩?、金魚草和矮牽?；ㄉ蛔凅w的研究，Holton等［5］第一次詳細總結了植物花青苷生物合成途徑?；ㄇ嘬蘸铣善鹗加诒奖彼岽x產生的香豆素-輔酶A和乙酸代謝途徑產生丙二酰-輔酶A，在查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）的催化下，1分子香豆素-輔酶A和3分子的丙二酰-輔酶A形成4-羥基查爾酮，經查爾酮異構酶（Chalcone isomerase，CHI）催化，4-羥基查爾酮生成柚苷配基，在黃烷酮-3-羥化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F3H）、黃烷酮-3'-羥化酶（Flavonoid 3'-hydroxylase，F3'H）和黃烷酮-3'，5'-羥化酶（Flavonoid 3'，5'-hydroxylase，F3'5'H）催化下，柚苷配基產生矢車菊色素和飛燕草色素，經二氫黃酮醇-4-還原酶（Dihydroflavone alcohol-4-reductase，DFR）還原成無色花青素，再經無色花色素雙加氧酶或花青素合成酶（Leucoanthocyanidin dioxygenase，LDOX或ANS）催化產生顯色花青素，在葡萄糖基轉移酶（Flavonoid/anthocyanidin 3GT，UFGT）的作用下，完成糖基化修飾，生成各種花青苷。最后，O-甲基轉移酶（O-methyltransferase，OMTs）完成甲基化修飾，產生錦葵色素、芍藥色素和矮牽牛色素等最終產物［6-11］。植物中花青苷的生物合成十分保守。近幾十年來，隨著分子生物學的興起，花青苷生物合成途徑基因在薔薇科果實中也不斷被克隆。使用軟件Clustalx和網站BoxShade（https：//embnet.vitalit.ch/software/BOX_form.html），對花青苷生物合成途徑關鍵基因CHS、DFR和UFGT在擬南芥及常見薔薇科不同種屬部分物種（表1）間進行蛋白多序列比對，結果發現這3個基因蛋白序列都較為保守；CHS、DFR這2個基因的蛋白序列在擬南芥中存在明顯的分化，但在薔薇科果實中十分保守（圖1-A、1-B）；相較于CHS、DFR而言，雖然UFGT序列上存在差異，但其蛋白相似性依然較高（圖1-C）。盡管在薔薇科不同種屬果樹中都找到了控制花青苷生物合成的基因，但由于基因表達以及拷貝數不同，造成了不同果實積累的花青苷種類和含量存在差異。

表1 常見薔薇科植物種屬信息

細胞質中形成的花青苷轉移到細胞液泡中進行儲存。液泡內穩定的環境使花青苷免于降解而顯示多種顏色。近年來，科學家們在研究如何提高花青苷生物合成途徑基因表達量的同時，也關注花青苷液泡轉運對于果實積累花青苷的決定性影響。目前，在薔薇科果實花青苷轉運方面，主要集中在對多藥與毒性化合物排出轉運蛋白（Multidrug and toxic compound extrusion，MATE）和谷胱甘肽-S-轉移酶（Glutathione-S-transferase，GST）轉運體的研究。薔薇科不同種屬果實中GST轉運蛋白序列相對保守（圖2）。Gomez等［12］通過對葡萄轉基因毛狀根花青苷自發熒光的分析，揭示了MATE對參與以小囊泡為介質，轉移花青苷到液泡這個過程中所起的關鍵作用，而GST轉運體則可能通過直接結合花青苷的方式完成液泡轉運。GST對花青苷轉運的重要影響先后在草莓、蘋果、梨、桃等果實上得到證實［13-16］。薔薇科不同種屬果實中GST轉運蛋白序列相對保守（圖2）。

2 調節基因對花青苷積累的影響

植物花青苷生物合成基因的表達受MYB-bHLHWD40，即MBW復合體的調控，作用機制相對保守。MBW復合體是由MYB轉錄因子（蛋白序列含一至多個MYB結構域）、bHLH轉錄因子（蛋白具有螺旋-環-螺旋結構）和WD40蛋白（蛋白由40個左右的氨基酸殘基組成，具有保守WD序列）特異互作形成（即MYB與bHLH直接互作，bHLH與WD40直接互作，這種互作在蘋果果實中得到驗證［17］）。對模式植物擬南芥花青苷形成的調控機理研究表明，AtMYB11/12/111等MYB轉錄因子對花青苷生物合成的早期基因AtCHS、AtCHI、AtF3H和AtF3'H有激活表達的作用，后期合成基因AtDFR、AtLDOX、AtUFGT的表達受AtMYB75/90/113/114等形成的MBW復合體進行調控［18-19］。由此可見，MYB轉錄因子對花青苷生物合成基因的調節起著至關重要的作用。MYB轉錄因子由于其結構域數量的差異，功能而有所不同。目前在薔薇科果實花青苷研究領域，主要集中在對R2R3 MYB轉錄因子的研究。

圖1 主要薔薇科植物CHS（A）、DFR（B）和UFGT（C）蛋白多序列比較

圖2 主要薔薇科植物GST轉運蛋白多序列比較

在不同蘋果品種中分離得到MdMYB1、MdMYB10、MdMYBA這3個高度同源的R2R3類型MYB基因，MdMYB1和MdMYBA對蘋果果皮著色起關鍵作用［20-21］，而蘋果果肉著色主要受MdMYB10調控［22］。另外，對蘋果果實外源施加茉莉酸后，MdMYB9和MdMYB11表達量升高，二者可與MdLDOX、MdANR和MdLAR的啟動子結合，促進花青苷和原花青苷的生物合成［23］。MdMYB24L被激活表達并作用于MdUFGT啟動子上，促進花青苷積累［24］。與擬南芥同源的MdMYB3能激活MdCHS、MdCHI、MdUFGT、MdFLS等基因的表達，促進包括花青苷在內的眾多黃酮類物質積累［25］。蘋果MdMYB308L受冷害誘導表達，協同MdbHLH33增強與MdCBF2和MdDFR啟動子的結合，促進蘋果果實著色［26］。

從沙梨（Pyrus pyrifolia）和西洋梨（Pyrus communis）果實中克隆得到的PyMYB10和PcMYB10兩個R2R3類型基因［27-28］對花青苷積累起著決定性作用。Feng等［29-30］通過全基因分析，從不同沙梨品種中克隆了另外2個促進花青苷積累的R2R3類型MYB轉錄因子：PyMYB10.1和PyMYB70。PyMYB10.1的作用模式和PyMYB10相同，通過與PybHLH形成復合體，激活花青苷生物合成基因表達。庫爾勒香梨（Pyrus bretschneideri Rehd）PbMYB10b和PbMYB9通過激活PbDFR和PbUFGT的表達，促進花青苷生物合成［31］。梨果實著色的原因則是位于5號連鎖群的PyMYB114與PyERF3、PybHLH3形成復合體，共同激活下游靶基因的結果［32］。

對花青苷生物合成起關鍵作用的R2R3類型MYB轉錄因子，在其他薔薇科果實中也逐漸被報道發現。草莓FaMYB10、中國李PcMYB10.6、桃PpMYB10.1、甜櫻桃PavMYBA和PavMYB10.1、杏PaMYB10等基因已被證實對果實的花青苷積累有重要作用［33-38］。在不同品種桃果實中，位于3號染色體串聯重復的PpMYB10.1、PpMYB10.2、PpMYB10.3基因表達存在差異，其中，PpMYB10.1對桃果實花青苷生物合成起著最為關鍵的作用［10，34，39］。MYB轉錄因子除了有促進花青苷生物合成的作用外，一些還具有抑制花青苷積累的作用。在擬南芥的研究中發現，R2R3類型MYB轉錄因子中AtMYB4/6/7/32抑制花青苷合成。目前對薔薇科果實花青苷抑制型轉錄因子的研究，同樣集中在R2R3類型MYB轉錄因子，如草莓FaMYB1（從Fragaria×ananassa克隆得到）和FcMYB1（從Fragaria chiloensis克隆得到）、桃PpMYB18、蘋 果MdMYB16和MdMYB15L、梨PbMYB120等［40-45］。這些R2R3型MYB轉錄因子大多數是由于其蛋白C端存在EAR 抑制基序，且與激活型MYB競爭性結合bHLH轉錄因子，從而減弱花青苷生物合成基因的表達，抑制果實著色。

MYB轉錄因子除了可以直接激活花青苷生物合成基因表達外，還能直接促進花青苷轉運蛋白的表達，促進花青苷的液泡轉運。從草莓誘變產生的白色品種YW5AF7中克隆得到的FaMYB10轉錄因子雖然能直接促進FaGST的表達，但由于FaGST編碼的蛋白提前終止使得花青苷無法正常轉運至液泡中，從而導致白色性狀產生［13］。蘋果中重要的花青苷轉運蛋白MdGSTF6受MdMYB1調控表達，直接影響花青苷的液泡積累［14］。

使用軟件Clustalx和MEGA6.0，對調節花青苷生物合成基因MYB轉錄因子構建 Neighbor-Joining系統進化樹，結果圖3所示，綠色和紅色覆蓋區域分別代表促進型和抑制型MYB轉錄因子。這些MYB明顯分成兩大組：其中由綠色線條組成的區域與擬南芥AtMYB75/90/113/114親緣關系較近，是其同源基因的促進型MYB轉錄因子；紅色線條組成的區域中既包含AtMYB4/6/7/32、FcMYB1、PpMYB18和MdMYB16等在內的抑制型MYB轉錄因子，也包含AtMYB11/12/111、MdMYB3、MdMYB9和PbMYB9等在內的促進型MYB轉錄因子，系統進化關系較為復雜。

3 外界環境因素對果實著色的研究

植物感受外界環境變化會產生一系列的代謝反應。光照和溫度等外界環境的刺激能引起薔薇科果實花青苷積累發生顯著變化。光照對花青苷積累的影響主要由光強和光質2個因素決定，蘋果果實在黑暗環境下，細胞核內的E3泛素連接酶MdCOP1蛋白介導在花青苷積累過程中起重要作用的MdMYB1轉錄因子的降解［46］。光照能夠激活細胞內多條信號通路，促進果實花青苷積累：首先，黑暗條件下，COP1會泛素化降解MdMYB1，光照刺激下，光受體（紅光受體PhyA/B，藍光受體CRY1/2、紫外受體UVR8）會競爭MdMYB1與COP1互作，有效避免MdMYB1降解而穩定存在于細胞核內；其次，光照能夠誘導表達光信號途徑重要轉錄因子MdHY5，并直接結合MdMYB10啟動子E/G-box元件，促進MdMYB10基因表達［47］；另外，光照條件會激活MdBBXs表達。MdBBX1能增強MdMYB10行使其激活花青苷生物合成基因表達的功能［48］，MdBBX37與MdMYB1互作后負調控果實著色［49］；高光誘導表達MdTCP46蛋白與MdMYB1轉錄因子形成復合體，增強MdMYB1對下游靶基因的激活能力［50］；光照促進MLNC3.2 和 MLNC4.6 這2個lncRNA（長鏈非編碼RNA）的表達，介導miR156a對花青苷的調節［51］。梨PyMYB10基因啟動子區域存在光響應元件，其表達量隨光照直接發生變化［27］，光照同時刺激PyBBX16表達，協同PyHY5轉錄因子共同激活PyMYB10的表達［52］。二倍體草莓品種“Ruegen”（Fragaria vesca）的果實在光照刺激后，被激活表達的FvbHLH9和FvHY5形成二聚體并結合在下游靶基因FvDFR啟動子上，促進果實花青苷的生物合成［53］。

光質對植物的生長發育至關重要，不同光質對果實花青苷積累影響存在差異。Tao等［54］通過比較不同光質對“紅早酥”梨果實著色的影響發現，紅光對花青苷的影響小，藍光則能明顯促進果實著色。Ni等［55］證實在藍光條件下，上調表達的Py4ERF24和Py12ERF96轉錄因子與PyMYB114互作，共同增強對下游靶基因PyUFGT的激活作用，促進梨果實花青苷積累。藍光能激活草莓花青苷生物合成途徑基因表達，促進果實著色［56］。Zhao等［57］發現桃果實對不同的紫外線響應存在品種差異性，紫外線激活PpHYH（HY5 Homolog）、PpGST等蛋白的表達，促進桃果實花青苷積累。紫外線處理促進蘋果果實花青苷積累至少存在兩條途徑：MdBBX20和MdBBX22表達升高，協同MdHY5增強對下游靶基因MdMYB10、MdCHS的激活［58-59］；表達升高的MdWRKY72結合MdHY5和MdMYB1基因啟動子W-box元件，促進果實著色［60］。

溫度會顯著影響薔薇科果樹花青苷的積累，并對花青苷的穩定性產生影響。低溫處理能促進蘋果果實花青苷的積累。一方面，低溫脅迫增強了MdbHLH3表達，促進其對下游靶基因MdDFR、MdUFGT和MdMYB1的激活［61］；另一方面，MdMYB308L激活表達后協同MdbHLH33增強與MdCBF2和MdDFR啟動子結合［26］；低溫還能誘導MdBBX20表達，與MdHY5形成二聚體共同激活MdMYB10、MdCHS的表達［59］。高溫降低了調節蘋果花青苷形成的MBW復合體多種組分的轉錄水平［62］。溫度條件對草莓果實著色也有顯著影響：低溫能夠促進FaMYB10、降低FaMYB1的表達，從而促進花青苷積累，高溫影響花青苷的穩定性［63-64］。

圖3 主要薔薇科植物MYB調節基因系統進化關系

除了光照和溫度能影響薔薇科果實花青苷積累外，干旱脅迫、外源氮等處理等在一定程度上也能影響果實著色。干旱條件下，蘋果MdERF38激活表達，協調MdMYB1促進花青苷生物合成［65］。外源氮處理促進蘋果氮響應蛋白MdBT2表達并介導MdMYB1泛素化降解［66］。CO2處理草莓果實能下調花青苷生物合成基因表達，抑制采后著色［67］。

4 激素物質對花青苷積累影響的研究

植物激素是一些微量而能調節自身生理過程的有機化合物。激素對植物的生長發育有重要的調控作用。薔薇科果實花青苷積累受植物激素乙烯（Ethylene，ETH）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、脫落酸（Abscisic acid，ABA）、生長素（Auxin）等信號通路的影響。

乙烯影響植物成熟衰老，是果實產生的最重要激素之一。乙烯促進薔薇科蘋果、李等果實著色［68-70］。外源添加乙烯處理的蘋果果實，乙烯信號通路中MdEIL1和MdERF1B激活表達，直接提高MdMYB1和MdMYB9、MdMYB11等轉錄因子的表達量，促進果實花青苷積累［69-70］。乙烯對果實花青苷積累具有多重性。研究表明，梨果實施加乙烯處理后，PyMYB10、PyMYB114等轉錄因子被抑制表達，花青苷積累過程受阻［71］。

茉莉酸影響花青苷積累主要是通過其信號通路重要因子：JAZ蛋白發揮作用的。在擬南芥中，JAZ蛋白與調控花青苷生物合成的bHLH轉錄因子互作，影響了MBW復合體的功能，抑制花青苷生物合成［72］。在蘋果中，茉莉酸可以通過不同的JAZ蛋白發揮調控作用。MdJAZ2可通過結合MdbHLH3進而抑制后者與MdMYB9、MdMYB11的結合作用，因此減弱MdMYB9、MdMYB112個轉錄因子對MdUFGT的激活［23］；MdJAZ8、MdJAZ11可以靶向MdMYC2（bHLH轉錄因子），抑制MdMYC2與MdMYB24L結合，從而抑制MdMYB24L對MdUFGT的轉錄［24］。在外源施加JA后，JAZ蛋白被泛素途徑降解，從而促進蘋果花青苷生物合成基因的表達。同樣，梨果實外源添加JA處理后，上調表達的PbERF22增強了PbMYB10對下游PbUFGT的轉錄活性，促使梨果實著色［73］。

脫落酸促進薔薇科果實蘋果、甜櫻桃等花青苷積累［36，74］，蘋果MdZIP44受脫落酸誘導表達，協同MdMYB1增強蘋果果實花青苷生物合成［74］。生長素影響草莓、紅樹莓和蘋果等薔薇科果實著色［75-77］。對蘋果研究表明，生長素通過“MdIAA121-MdARF13”模塊介導對花青苷的積累［77］。赤霉素通過其信號通路中不同的酶發揮調節花青苷積累的作用。模式植物擬南芥赤霉素抑制活性酶AtGA2ox1以依賴AtHY5、AtHYH的方式，參與低溫誘導花青苷的過程［78］。在梨果實中，赤霉素途徑酶PbGA2ox8能誘導果皮花青苷積累，使果皮呈現條狀紅色［79］。此外，細胞分裂素和油菜素甾醇對薔薇科果實花青苷積累也有報道。細胞分裂素處理蘋果果實，MdMYB10基因上調表達，抑制因子MdMYBL2下調表達，共同促進蘋果果實花青苷積累［80-81］。油菜素甾醇處理能上調表達蘋果果實花青苷生物合成途徑及關鍵MYB轉錄因子的表達水平，促進果實花青苷積累［82］。

5 小結

花青苷作為一種重要的抗氧化劑，對薔薇科植物果實著色起著至關重要的影響。如何提高果實的花青苷含量既是消費者提出的現實要求，也是果樹學家們研究的重點方向。在薔薇科植物不同果實中，花青苷生物合成基因及花青苷轉運基因相對保守，其功能也大致相同，但調節機制存在差異。目前，在薔薇科植物不同果實中均克隆得到AtMYB75/90/113/114的同源MYB基因（圖3，綠色線條分支），這些MYB轉錄因子調節花青苷生物合成作用機制基本相同。但在蘋果、梨等果實中還發現了其他MYB轉錄因子，如蘋果MdMYB9、MdMYB11、MdMYB308L和梨PyMYB70、PyMYB114等促進型MYB轉錄因子及MdMYB15L、MdMYB16和PbMYB120等抑制型MYB轉錄因子，這表明MYB基因在不同物種中各自分化，在不同的外界或激素響應中起調節作用，發掘不同果實中的MYB調節因子仍是關鍵。

薔薇科植物果實花青苷積累調節機制存在差異，不同果實對外界環境或激素處理的響應不同：蘋果、草莓等果實著色必須依賴于光照，而桃果實花青苷積累可以不依靠光照，產生“近核紅”這一現象；乙烯處理促進蘋果、草莓等果實其著色，而抑制梨果實花青苷生成。對于如何提高果實花青苷生成，以往的研究往往集中于某單一因素，但最近的研究發現，環境因子和激素信號通路可以聯系在一起。如提高碳供給能介導赤霉素、茉莉酸、細胞分裂素和脫落酸等激素信號關鍵因子對果實花青苷的促進作用［83-86］。這些研究結果表明，外界環境因素可以直接或間接影響薔薇科果樹激素代謝水品，從而影響著色。也就是說，對果實采取多因素協調控制，可以更好地促進果實著色。