基于多元統計分析的不同訶子屬藥材多指標成分研究

李國衛，索彩仙，吳文平，潘禮業，胡綺萍，何嘉瑩，孫冬梅

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，佛山 528244

2020年版《中國藥典》收載的訶子屬藥材品種有訶子、絨毛訶子、西青果。訶子性苦、酸、平，歸肺、大腸經，為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.或絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的成熟果實，每年的秋、冬季果實成熟的時候采收；西青果別名藏青果，是使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥幼果[1]，每年的9～10月將尚未成熟的幼果采下，置于沸水中略煮燙，曬干或者是烘干。訶子、絨毛訶子及西青果化學成分較為相似，以可水解類鞣質為主[2-4]，還含有多酚類、黃酮類等化學成分。訶子具有抗病毒、抗炎、降血糖和鎮咳等藥理作用[5,6]，西青果清熱生津，解毒，主治陰虛白喉，具有清除羥自由基、抗氧化等功效，臨床常用于咽喉腫痛、咽炎等癥狀[7]，兩者的藥理作用、性味功效存在較大不同[8]。

目前針對訶子屬的研究多以單個品種的含量測定及特征圖譜為主，但未見有對訶子屬藥材的整體質量研究[9-14]。Zhao等[15]基于化學成分預測了訶子的Q-marker可能為沒食子酸、訶子酸、訶藜勒酸、鞣花酸，在此基礎上，本研究擬通過建立多指標含量測定方法，利用化學模式識別法，包括方差分析、聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，探討訶子、絨毛訶子和西青果三者的差異，以期為訶子屬藥材的質量評價及資源利用提供參考依據。

1 儀器與材料

Waters H-Class型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；XP-26型百萬分之一天平，ME204E型萬分之一天平(瑞士Mettler公司)；Milli-Q超純水凈化系統(美國Millipore公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

沒食子酸對照品(批號：110831-201906，含量：91.5%)、柯里拉京對照品(批號：111623-200301，含量：≥98%)，由中國食品藥品檢定研究院提供；訶子次酸對照品(批號：Yz0613211，含量：≥98%)由南京源植生物科技有限公司提供；安石榴苷(A&B)對照品(批號：CFS201901，含量：≥98%)、訶藜勒酸對照品(批號：CFS201901，含量：≥98%)、訶子酸對照品(批號：CFS201902，含量：≥98%)，由武漢天植生物技術有限公司提供；甲醇、乙腈為色譜純；水為純化水；其余試劑為分析純。

實驗所用藥材共44批，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，H1～H17號樣品為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥成熟果實；X1～X14號樣品為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥幼果；RH1～RH13為使君子科植物絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實，詳細信息見表1。

表1 藥材信息來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～3 min，0%A；3～5 min，0%→3%A；5～12 min，3%→10%A；12～20 min，10%A；20～25 min，10%→14%A；25～35 min，14%→17%A；35～40 min，17%→21%A；40～45 min，21%→60%A；45～50 min，60%A)，流速為0.35 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為270 nm。

2.2 對照品溶液制備

取訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷(A&B)、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為413.560、105.271、519.400、116.700、1609.552、495.635 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過三號篩)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適應性

取“2.2”項下的對照品儲備液，供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在1.00～1.05之間?；旌蠈φ掌啡芤杭肮┰嚻啡芤阂妶D1。

圖1 對照品、供試品UPLC圖Fig.1 UPLC chart of reference substance and sample注：A：混合對照品；B：訶子；C：西青果；D：絨毛訶子。1：訶子次酸；2：沒食子酸；3：安石榴苷A；4：安石榴苷B；5：柯里拉京；6：訶藜勒酸；7：訶子酸。Note:A:Mixed references;B:Mature fruit of T.chebula Retz.;C:Immature fruit of T.chebula Retz.;D:Mature fruit of T.chebula Retz.var.tomentella Kurt.1:Chebulic acid;2:Gallic acid:3:Punicalagin A;4:Punicalagin B;5:Corilagin;6:Chebulagic acid;7:Chebulinic acid.

2.4.2 線性范圍

取“2.2”項下的對照品儲備液，加甲醇稀釋制得6個不同質量濃度的對照品溶液，其中訶子次酸質量濃度分別為0.345、3.446、34.463、206.780、413.560、620.340 μg/mL，沒食子酸質量濃度分別為0.351、3.509、35.090、105.271、210.542、315.812 μg/mL，安石榴苷A+B質量濃度分別為2.841、28.410、259.700、519.400、831.040、1 038.800 μg/mL，訶藜勒酸質量濃度分別為0.340、3.404、34.039、1 005.970、1 609.552、2 011.940 μg/mL，柯里拉京質量濃度分別為0.389、3.890、38.900、116.700、233.400、350.100 μg/mL，訶子酸質量濃度分別為0.346、3.459、34.594、495.635、793.016、991.270 μg/mL,以峰面積為縱坐標(y)，質量濃度(μg/mL)為橫坐標(x)進行線性回歸，得到各個對照品的線性關系良好，R2值均值0.999 5以上，結果見表2。

2.4.3 精密度試驗

取同一供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續進樣6次，訶子酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗

取同一供試品溶液，按“2.1”項下的的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定，訶子酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.4.5 重復性試驗

取樣品粉末約0.25 g，平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，訶子酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率考察

精密稱取已知含量的訶子藥材(H17)0.125 g，平行6份，加入與樣品中含量等量的對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。測得7個成分平均加樣回收率均在97.34%～99.75%，RSD<3%，結果見表3。

表2 回歸方程及線性范圍

表3 加樣回收考察

續表3(Continued Tab.3)

2.4.7 結果與分析

2.4.7.1 含量測定結果

精密稱取44批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得到含量測定結果，見表4。結果顯示，3種藥材的7個成分含量存在顯著差異，RSD在33.03%～77.32%之間。其中，RSD≥50%的包括6個成分，分別為沒食子酸(49.5%)、安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸；訶子次酸在不同批次樣品中較為穩定，RSD為33.03%。

表4 含量測定結果

續表4 (Continued Tab.4)

2.4.7.2 方差分析

以上述7個含量測定指標為檢驗變量，訶子、西青果、絨毛訶子作為分組變量，采用SPSS 20.0軟件，通過Shapiro-Wilk檢驗法對44批藥材樣品7個成分數據進行正態分布驗證，結果顯示7個指標的sig.值均小于0.05，不服從正態分布；因此采用非參數檢驗法(秩和檢驗)進行下一步分析，選擇Kruskal-Wallis法進行對三個不同基原的7個指標進行兩兩比較，結果見表5。其中，安石榴苷A & B、訶藜勒酸在三組樣品間均有極顯著差異(P<0.01)；訶子次酸在訶子與西青果、西青果與絨毛訶子間有極顯著差異(P<0.01)，在訶子與絨毛訶子間無顯著差異；柯里拉京在訶子與絨毛訶子、西青果與絨毛訶子間有極顯著統計學差異(P<0.01)，在訶子與西青果無顯著差異；沒食子酸在訶子與絨毛訶子、訶子與西青果間有極顯著差異(P<0.01)；在絨毛訶子與西青果間無顯著差異；訶子酸在西青果與絨毛訶子、訶子與絨毛訶子間有極顯著差異(P<0.01)，在訶子與西青果間無顯著差異；上述分析結果說明訶子、西青果、絨毛訶子三者間的成分含量存在差異。

表5 各含量指標分析表

2.4.7.3 聚類分類

運用SPSS軟件對44批藥材樣品7個成分的含量測定結果進行系統聚類，采用組間平均數聯結法，以余弦距離作為樣品相似度的距離公式，樣品聚為3類(見圖2)。13批絨毛訶子樣品(RH1～RH13)聚為一類，14批訶子樣品(H1～H14)聚為一類，14批西青果樣品(X1～X14)與3批訶子(H15～H17)樣品聚為一類。從總體數據來看，不同品種藥材樣品間具有明顯差異，其中絨毛訶子與其他兩種藥材的差異較大，距離為25時就可以歸為不同的類型；西青果和訶子具有一定的相似性，當距離為20時，可以聚為一類，當距離為15時，兩者可以區分，但仍然有部分訶子樣品未能在西青果樣品中分離，在距離為5時才能完全分離，說明兩者具有較高的相似性。

2.4.7.4 主成分分析

以7個成分含量測定結果為變量，采用SPSS 22.0軟件進行主成分分析，由表6可知，共提取了2個特征值大于1的主成分，累積方差貢獻率達86.674%，表明可以用2個主成分反映不同樣品主要的質量特征。從表7可以看出，在第一主成分有較高載荷的包括安石榴苷A&B、柯里拉京、訶藜勒酸；在第二主成分有較高載荷的包括沒食子酸、訶子酸。(載荷值>0.80)以降維得到的2個主成分得分作為X、Y軸，得到44個樣品的散點分布圖，結果顯示，3種藥材樣品能實現較好區分，同類樣品基本能聚在同一區域，說明3種藥材之間的成分存在一定差異，結果見圖4。三批訶子樣品(H15～H17)與西青果樣品聚在同一區域，與聚類分析結果一致。3種樣品的主成分得分分析：西青果樣品除X1的主成分2評分為-0.08外，2個主成分評分基本為正值；絨毛訶子樣品主成分1評分均為負值，主成分2評分除個別批次(RH1)外均為正值；訶子樣品除H15～H17外，其他樣品的兩個主成分評分基本為負值，結果見表8。

圖2 44批藥材樣品聚類分析結果Fig.2 Cluster analysis results of 44 batches of samples

2.4.7.5 OPLS-DA

依據PCA結果，對3種不同藥材樣品進行OPLS-DA分析。該OPLS-DA模型，R2X(cum)=0.976，R2X(cum)=0.936，Q2(cum)=0.923，均大于0.5，說明模型穩定可靠，可用于使君子科不同藥材樣品的區分。結果顯示，數據的分類算法中OPLS-DA的效果較好，可使3種樣本點完全被分開，相互之間沒有樣品出現交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區間之內，說明3種樣品在這7種化學成分含量上存在一定的差異，結果見圖5。采用變量重要性投影值(ariable importance in project，VIP)篩選體現3種樣品差異性的標志物，其中VIP值大于1的成分包括3個，分別為訶子酸(VIP=1.06)、安石榴苷A&B(VIP=1.01)，是體現3種樣品間差異的主要標志性成分，其余峰VIP值小于1，對樣品的區分影響較小，結果見圖5。

表6 特征根、各主成分的貢獻率

表8 主成分得分

圖3 主成分得分分布圖Fig.3 Score plot of principal components

3 分析與討論

3.1 檢測條件的確定

安石榴苷A與安石榴苷B為一對同分異構體，且容易發生相互轉化，本研究已在色譜條件下將兩者分離，呈雙峰，但考慮到兩者容易發生相互轉化若單獨計算會影響加樣回收率的計算，故以2個色譜峰峰面積之和計算。在200～400 nm處進行全波長掃描，訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸在270 nm均有最大吸收，故選擇270 nm為同時測定波長。

圖4 OPLS-DA得分圖Fig.4 Score plot of OPLS-DA注：橫坐標t[1]為預測主成分值；縱坐標t[2]為正交主成分值。Note:X-axis is predicted principal component value;Y-axis is orthogonal principal component value.

圖5 7個化學成分的VIP值Fig.5 VIP value of 7 chemical components

3.2 多指標含量測定結果分析

本研究測定了2020年版《中國藥典》收載的3種訶子屬藥材訶子、絨毛訶子、西青果中7種化學成分的含量，并結合方差分析、聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法 - 判別分析等化學計量法分析了不同種藥材含量的差異。方差分析結果顯示，訶子次酸、安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸5個成分在西青果中含量均值均最高，且與其他兩種藥材的含量均值均有明顯差異，P<0.05具有統計學意義；訶子酸在訶子中含量均值最高，且與其他兩種藥材的含量均值均有明顯差異(P<0.01)具有統計學意義；沒食子酸在絨毛訶子中含量最高，但與西青果的含量差異不大，但兩者與訶子的含量均值有明顯差異((P<0.01)具有統計學意義。聚類分析、主成分分析與正交偏最小二乘法-判別分析均可以將不同樣品按品種進行劃分，主成分分析結果顯示安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、沒食子酸、訶子酸為體現不同品種差異的主要因素，正交偏最小二乘法-判別分析結果顯示訶子酸、安石榴苷A&安石榴苷B為區分不同品種的主要因素。綜上可見，不同訶子屬藥材的化學成分組成較為接近，其差異主要體現在不同化學成分的含量上，安石榴苷A、安石榴苷B、訶子酸、柯里拉京、訶藜勒酸、沒食子酸等成分在不同訶子屬藥材間的差異較大，建議建立對訶子屬藥材的進行多指標質量控制，才能全面評價該類藥材的質量。

在主成分分析結果中有三批訶子樣品(H15～H17)其得分分布與西青果靠近，分析含量測定數據發現，這三批樣品的含量數據均接近訶子、西青果整體含量均值的中間值，而訶子為使君子科植物訶子干燥成熟果實，而西青果則為使君子科植物訶子的干燥幼果，推測可能是由于果實成熟度不足導致。從本研究中的結果可以看出，除訶子酸外，訶子的其余6個指標均遠低于西青果，訶子酸則大幅度高于西青果，說明訶子在成熟的過程中，其含量組成會發生轉化，也從另一方面為訶子與西青果藥效特點不一致提供了依據。

本研究建立了訶子屬藥材7個指標成分的UPLC含量測定方法，對44個不同藥材樣本進行了測定，并采用方差分析、聚類分析、主成分分析與正交偏最小二乘法-判別分析對含量測定結果進行了分析，分析結果顯示3種訶子屬藥材的成分組成存在明顯差異，為訶子屬藥材的質量控制提供了可靠的分析方法與參考依據。