西羅莫司對高脂飲食誘導的NAFLD大鼠外周血Treg/Th17細胞的影響*

榮愛梅，張 超，吳慧麗

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發病與遺傳和胰島素抵抗相關[1]。NAFLD可逐漸發展為肝硬化。近年來，研究顯示NAFLD可能是肝細胞癌的潛在誘因[2]。國內流行病學調查發現在特殊人群NAFLD發病率可達75%，已成為威脅公共健康安全的常見病[3]。西羅莫司屬免疫抑制劑。有基礎研究顯示西羅莫司有助于改善肝臟脂質代謝[4]，但有關西羅莫司的臨床應用尚存爭議。調節性T細胞(regulatory T lymphocyte，Treg)/輔助性T細胞17(T help cell 17，Th17)在穩定機體免疫功能和炎癥反應過程中發揮重要作用，推測西羅莫司可能通過影響Treg/Th17比值進而影響NAFLD進展[5]。本研究應用西羅莫司干預NAFLD模型大鼠，分析了其對動物外周血Treg/Th17比值的影響，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 60只清潔級SD大鼠，體質量為150～200 g，平均為(175.4±24.2)g，由重慶醫科大學動物實驗中心提供。采用隨機數字表法將60只大鼠分為對照組、模型組和西羅莫司干預組，每組20只。

1.2 NAFLD模型制備與處理 在西羅莫司干預組和模型組，給予高脂飲食喂養12 w，建立NAFLD動物模型。高質飲食由80%普通飼料與20%高脂飼料混合構成，其中80%普通飼料為小麥30%、玉米30%、魚粉10%、骨粉3%、豆粕7%；20%高脂飼料為膽固醇3%、豬油7%、蛋黃粉10%。在對照組大鼠，給予普通飼料喂養14 w。在建模成功后，給予一組動物西羅莫司干預，即繼續給予高脂飲食喂養2 w，同時給予西羅莫司(國藥準字H20051140，福建科瑞藥業有限公司)1 mg.kg-1.d-1灌胃，連續干預2 w；在模型組，在建模成功后繼續給予高脂飲食喂養2 w。在實驗結束時，給予水合氯醛腹腔注射麻醉，取血后處死大鼠，摘取肝臟，行組織病理學檢查。

1.3 實驗室檢測 采用ELISA法檢測血清白介素-10(interleukin-10，IL-10)、IL-17和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平；使用全自動生化分析儀(械注進20112400234)檢測肝功能和血脂血清生化指標；使用FACSVia型流式細胞儀(械注進20172402482)檢測外周血Treg和Th17細胞百分比(福建三一造血技術有限公司)。

2 結果

2.1 三組肝組織病理學表現 見圖1。

圖1 三組肝組織病理學表現 (HE，200×) A：西羅莫司干預組，可見少量肝血竇充血，肝細胞體積增大，脂肪變減輕；B：模型組可見肝細胞脂肪變性，肝細胞體積大小不等，部分肝竇充血；C：對照組肝小葉結構正常，肝細胞索排列整齊

2.2 三組肝功能指標比較 干預后，西羅莫司干預組血清ALT和AST水平顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 三組肝功能指標比較

2.3 三組血脂指標比較 干預后，西羅莫司干預組血清TC和LDL-C水平顯著低于模型組，而血清HDL-C水平顯著高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05，表2)。

2.4 三組細胞因子水平比較 干預后，西羅莫司干預組血清IL-17和TNF-α水平顯著低于模型組，而血清IL-10水平顯著高于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05，表3)。

2.5 三組外周血Treg/Th17細胞比較 干預后，西羅莫司干預組外周血Treg和Treg/Th17比值顯著高于模型組，Th17細胞百分比顯著低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05，表4)。

表2 三組血脂指標比較

表3 三組細胞因子比較

表4 三組Treg/Th17細胞比較

3 討論

NAFLD發病機制尚未完全闡明。目前認為，NAFLD的發生存在二次打擊學說，二次打擊不僅直接損壞肝組織，啟動和加快病變進程，還增加了肝細胞壞死凋亡的易感性，臨床多通過抑制炎癥反應、改善肝纖維化及抗氧化應激控制NAFLD進展[6，7]，但對NAFLD治療效果仍有限。如何改進NAFLD治療效果成為臨床和基礎實驗研究的重點。西羅莫司是首先由加拿大學者發現的免疫抑制劑，既往研究多用于器官移植和抗腫瘤治療[8，9]。有人發現西羅莫司可顯著改善肝脂肪變程度，可能為西羅莫司用于治療NAFLD提供了依據[10]。

研究認為采取高脂飲食建立的NAFLD大鼠模型與人類NAFLD疾病極為相近[11]。本研究采用高脂飲食喂養12周的方法建立NAFLD大鼠模型，并給予西羅莫司平行對照干預，結果顯示干預后西羅莫司干預組動物血TG、TC和LDL-C水平顯著低于模型組，提示西羅莫司有助于改善NAFLD大鼠血脂水平。研究也發現西羅莫司能糾正胰島素受體底物1磷酸化進程，并阻斷膽固醇聚集，進而達到改善脂代謝水平的目的[12]。但臨床也有報道認為西羅莫司可能通過抑制血脂降解過程誘發高脂血癥[13]，但其具體機制尚不明確，有學者認為對于肝功能穩定期的患者，西羅莫司對血脂水平無顯著的影響[14]。

炎癥反應與NAFLD病理進展關系密切。既往報道認為炎癥可直接阻斷胰島素信號通路，并誘發肝纖維化，損傷肝內皮細胞[15，16]。IL-10是機體抗纖維化和免疫調節重要的細胞因子，可通過抑制單核巨噬細胞的激活達到抑制炎癥反應和降低肝內細胞浸潤的作用[17，18]。IL-17是含有155個氨基酸的促炎因子，通過刺激成纖維細胞，加快T細胞活化作用，促進肝損傷[19，20]。有研究結果顯示治療后對照組血清IL-17和TNF-α水平顯著低于西羅莫司干預組和模型組，血清IL-10水平顯著高于西羅莫司干預組和模型組[21]，提示炎癥反應參與了NAFLD的發生和發展。本研究進一步對比三組SD大鼠干預后血清IL-10、IL-17和TNF-α水平的變化，結果發現西羅莫司干預組血清IL-17和TNF-α水平顯著低于模型組，而血清IL-10水平顯著高于模型組，西羅莫司干預組與對照組之間無顯著性差異，提示西羅莫司可通過抑制炎癥反應，調節了外周血Treg/Th17細胞失衡狀態，達到了改善NAFLD的作用。本研究也顯示干預后西羅莫司干預組外周血Treg細胞百分比和Treg/Th17細胞比值均顯著高于模型組，而Th17細胞顯著低于模型組，提示西羅莫司可能通過調節輔助T細胞失衡狀態，抑制NAFLD的病理學進展。

報道認為西羅莫司可通過抑制CD36蛋白表達，減少大鼠肝臟對游離脂肪酸的攝取，進而改善肝臟脂質聚集現象[22]。本研究結果發現實驗結束時，西羅莫司干預組血清AST和ALT水平顯著降低，提示該藥能降低NAFLD大鼠血清酶水平，具有保護肝功能的作用[22]。有人認為維持4～8 ng/ml血藥濃度的西羅莫司比較安全，有助于保護肝功能[23]，但臨床也有學者發現應用西羅莫司可能增加發生肝功能異常的風險[24，25]，可能與應用的西羅莫司劑量和樣本量差異有關，有關西羅莫司對肝功能的影響還有待今后進一步觀察和研究。