基于果蠅模式生物刺玫果抗衰老活性及作用機制研究

翟春梅,白晨曦，石雅維,付敬菊,秦蓁,孟永海

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

刺玫果(RosamaximowiczianaRegel)具有健脾理氣、養血調經的作用，民間大量采食或用于泡茶、泡酒等，有“維生素記錄保持者”之稱。刺玫果野生資源豐富、廣泛生長在大小興安嶺原始森林之中，無任何污染，營養豐富，具有明顯的提高免疫力、改善人體疲勞和壯陽等保健功能，是一種多營養，多功能，多用途的藥食同源寶貴資源，而黑龍江省具有得天獨厚資源優勢且具有廣闊的開發前景。

野生刺玫果含有大量黃酮類、三萜類、皂苷等成分[1-5]，富含人體必需的微量元素，號稱“生命之花”“Vc之王”，被歐洲各國視為“治療壞血癥特效藥”[6]。刺玫果是一種安全無毒的天然資源，研究結果表明刺玫果具有明顯的抗衰老、抗疲勞、耐缺氧和類性激素[7-8]，預防心血管系統疾病、提高免疫力[9]，保肝、防癌、促智作用[10]及清除羥自由基及抗DNA損傷及抗輻射等作用。刺玫果可使老齡小鼠MDA含量降低，SOD、GSH含量明顯增加，肌、肝糖原含量顯著增加等抗衰老作用機制。

為了進一步探討刺玫果抗氧化抗衰老活性機制以及深入開發其保健功能及相關產品。本文以果蠅為模式生物模型，以果蠅壽命、攀爬能力等壽命相關行為學指標及MDA、SOD、GSH(與抗氧化相關重要指標)和糖原、LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶(與能量代謝相關重要指標)等為綜合考察指標，探討基于果蠅模式生物的刺玫果抗衰老活性機制。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

Canton S品系野生型黑腹果蠅(購自上海生命科學院)。

1.2 儀器與試劑

刺玫果(產自東北大興安嶺)；蔗糖(批號:20180103)；丙酸(批號：20170327)；酵母粉(批號：1439447-02)；瓊脂(批號：EZ1609C222)；梅特勒分析天平(型號：MS105)；BIOTEK酶標儀(型號：EPOCH 12)；THERMO紫外分光光度計(型號：EVOLUTION 260)；AL 204電子天平(美國METTLER TOLEDO公司)。

1.3 藥品的制備

刺玫果醇提物凍干粉的制備：以8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并回收乙醇后，凍干成粉備用。

1.4 實驗分組及給藥方法

果蠅培養基采用基礎培養基的制備方法：稱取蔗糖6.2 g,玉米粉8.4 g瓊脂0.6 g,加入蒸餾水92 mL，邊加熱邊攪拌，煮沸至糊狀后停止加熱，等待溫度降至(65±5)℃時，加入0.6 g酵母粉，在吸取0.6 mL丙酸攪拌均勻，立即分裝至果蠅指管中。給藥培養基的配制方法在普通培養基中添加高(1.845%)、中(0.46%)、低(0.115%)劑量的刺玫果醇提物凍干粉，對照組則給予正常培養基飼養。參照文獻方法加以改進[11-13]考察果蠅行為學。

1.5 果蠅抗氧化及能量代謝相關指標的檢測方法

果蠅收集與分組同上。在飼養第10日、20日、30日時，果蠅饑餓2 h后液氮速凍，快速移入-80 ℃冰箱中保存，需要時用生理鹽水研磨成10%的勻漿組織，按照試劑盒說明書檢測MDA、SOD、GSH等氧化相關指標和糖原、LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶等能量代謝相關指標。各試劑盒均用10%的勻漿組織測試。

1.6 統計學處理

2 實驗結果

2.1 刺玫果對果蠅行為學的影響

本研究首先考察了刺玫果醇提物對果蠅壽命及壽命相關行為學的影響，結果表明刺玫果醇提物具有抗衰老作用，可延緩果蠅壽命、改善果蠅壽命相關的行為學指標[1]。

2.2 刺玫果醇提物對不同時期果蠅體內丙二醛(MDA)含量的影響

隨著果蠅日齡的逐漸增加，其自身MDA含量呈明顯的增加趨勢，體內MDA含量與果蠅的衰老程度呈正比，中劑量組10日蠅MDA含量與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，高劑量組30日蠅雌果蠅與對照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。以空白組為例，雌果蠅10日齡MDA含量(1.897 mg/g)到30日含量(2.597 mg/g)MDA增加了0.7 mg，而高劑量組雌果蠅MDA只增加了0.155 mg/g，表明刺玫果醇提物可抵抗果蠅延緩衰老的作用，結果見表1。

2.3 刺玫果醇提物對不同時期果蠅體內超氧化物歧化酶(SOD)含量的影響

隨著果蠅日齡的增加，各組果蠅體內SOD含量呈現降低趨勢，結果發現，與空白組相比，給藥組各個階段SOD含量減少緩慢，而空白組SOD含量下降趨勢明顯。與對照組相比，20日齡各劑量組雌果蠅SOD含量呈現顯著性(P<0.05或P<0.01)，30日齡高、中劑量組雌果蠅與低劑量組雄果蠅SOD含量呈現顯著性(P<0.05)。各組雌雄果蠅無顯著性差異。結果見表2。

2.4 刺玫果醇提物對不同時期果蠅體內谷胱甘肽(GSH)含量的影響

隨著果蠅日齡的增加，各組果蠅體內GSH含量呈現降低趨勢，與空白組相比，給藥組各個階段GSH含量減少緩慢，而空白組GSH含量下降趨勢明顯。與空白對照組相比，高劑量組20日雌果蠅(P<0.01)和低劑量組20日齡雄果蠅(P<0.01)體內GSH含量均呈現顯著性差異，高劑量組30日齡果蠅(P<0.01)與中劑量組30日齡雌果蠅(P<0.01)體內GSH含量呈現顯著性差異，結果見表3。

2.5 刺玫果醇提物對不同時期果蠅體內糖原含量的影響

隨著果蠅日齡的增加，各組果蠅體內糖原含量呈現降低趨勢。與空白組相比，給藥組各個階段糖原含量減少緩慢，而空白組糖原含量下降趨勢明顯。與空白組相比，高劑量10日齡雌果蠅體內糖原含量呈現顯著性差異(P<0.05)，高、低劑量組20日齡雌果蠅糖原含量呈現顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，高劑量組和中低劑量組雌果蠅30日齡果蠅糖原含量呈現顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。值得注意的是，各個階段各個時期的雌果蠅體內糖原含量均高于雄果蠅，糖原含量可能和果蠅的性別差異有關。見表4。

2.6 刺玫果醇提物對不同時期果蠅體內LDH含量的影響

隨著果蠅日齡的增加，各組果蠅體內LDA含量呈現降低趨勢。與空白組相比，高、中劑量組10日蠅雌果蠅體內LDH含量呈現顯著性差異(P<0.05)，高、中劑量組果蠅和低劑量組20日雌果蠅體內LDH含量呈現顯著性差異(P<0.05或<0.01)；高劑量組30日蠅和中劑量組30日雄果蠅體內LDH含量呈現顯著性差異P<0.05)，且呈現明顯的劑量依賴性，見表5。

2.7 刺玫果醇提物對不同時期果蠅體內Na+-K+-ATP酶含量的影響

隨著果蠅日齡的增加，各組果蠅體內Na+-K+-ATP酶含量呈現降低趨勢。與空白組相比，低劑量組10日齡雌果蠅呈現顯著性差異(P<0.05)；高劑量組20日齡雌果蠅體內Na+-K+-ATP酶含量呈現顯著性差異(P<0.05)，中劑量組20日雄果蠅和低劑量組20日齡雌果蠅體內Na+-K+-ATP酶含量呈現顯著性差異(P<0.05)。高劑量組30日齡果蠅體內Na+-K+-ATP酶含量呈現顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。見表6。

2.8 刺玫果醇提物對不同時期果蠅體內Ca2+-Mg2+-ATP酶含量的影響

隨著果蠅日齡的增加，各組果蠅體內Ca2+-Mg2+-ATP酶含量呈現降低趨勢。與空白組相比，各劑量組10日齡雄果蠅呈現極顯著性差異(P<0.01)；高劑量組20日齡果蠅體內Ca2+-Mg2+-ATP酶含量呈現顯著性差異(P<0.05)；高劑量組30日齡果蠅和中劑量組30日齡雌果蠅體內Ca2+-Mg2+-ATP酶含量呈現顯著性差異(P<0.05)。見表7。

3 結語

果蠅壽命調控的生理生化機制結果發現胰島素/類胰島素生長因子、保幼激素、TOR信號網絡、熱量限制和飲食限制、氧化應激、腺苷酸活化蛋白激酶信號通路、鞘脂類代謝及小分子RNA都會對果蠅的壽命產生影響[14]。檢測動物的存活壽命是研究老齡化研究最直接的證據。

隨著生物年齡的增加，自由基促成的脂質過氧化物也增高[15]，當氧化自由基作用細胞中的脂類物質時，即產生MDA等分解產物。MDA作為機體脂質過氧化反應的最終代謝產物，其高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[16]。存在于生物體內的抗氧化酶系SOD，可有效地清除細胞代謝過程中產生的氧自由基[17]，GSH是生物體內氧自由基消除系統的重要防線，主要起對細胞膜結構和功能的保護作用[18]。研究發現刺玫果醇提物對30日齡果蠅體內MDA含量有顯著性作用，雖對中、低劑量組MDA含量無顯著差異，但是有降低趨勢；刺玫果醇提物對各劑量組20日齡和30日齡果蠅體內SOD、GSH含量均有不同程度的提高，這些充分說明刺玫果抗衰老的機制可能是清除自由基延緩衰老。

人體最重要的供能物質是糖類，維持機體活動需要的基本能量，糖類不但能參與細胞的多種活動而且是構成機體的重要原料。肝糖原儲備充足時，可供給機體足夠的糖分來減少其他供能物質如蛋白質的消耗增強抵抗力。本實驗對刺玫果醇提物的不同時期體內含糖量做出研究，結果發現隨著果蠅日齡的增加，果蠅體內糖原含量呈現降低趨勢，給藥組各個階段糖原含量減少緩慢，而空白組糖原含量下降趨勢明顯，刺玫果醇提物的高劑量組10、20、30日齡果蠅糖原含量明顯升高，呈現顯著性差異(P<0.05)，此實驗說明，給予果蠅一定劑量的刺玫果提取物，可能是維持機體有充足供能物質，使不同時期的果蠅保持相對活力的攀爬能力。有趣的是各劑量組各個時期的雌果蠅體內糖原含量均高于雄果蠅，糖原含量可能和果蠅的性別差異有關。

鈉鉀泵是一種特殊蛋白質，具有ATP酶活性，且鑲嵌在細胞膜上，作用是維持細胞內外的水平衡，也維持細胞內外的滲透壓平衡和正常的離子分布。Na+-K+-ATP酶位于細胞膜上，是維持細胞內外滲透壓平衡和細胞內外K+濃度平衡的重要供能物質[19]，內源性三磷酸腺苷(ATP)是活細胞代謝最重要的能量來源，而乳酸脫氫酶(LDH) 參與細胞的無氧代謝，是最重要的無氧酵解酶之一。刺玫果醇提物對各劑量不同時期果蠅體內Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶、LDH有不同程度的影響，尤以高劑量組效果最好，中劑量組次之，說明刺玫果可喂養果蠅后，可提高果蠅體內的物質代謝和能量代謝。

本實驗以果蠅為生物模式對刺玫果提取物的抗衰老作用進行研究，結果顯示，不同劑量的刺玫果醇提物均可延長果蠅壽命，且在一定濃度范圍內隨著濃度的升高，果蠅壽命與劑量呈依賴性[13]?？筛纳乒塎DA、SOD、GSH等氧化相關指標和糖原、LDH、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶等能量代謝相關指標。刺玫果醇提物可延長果蠅壽命，其機制與提高果蠅抗氧化作用和能量代謝密切相關。