R2A培養基的應用及有效期的驗證

馬樂，張博，劉元崢，苗靜，高志國，薄曉菲

（北京生物制品研究所有限責任公司，北京 100176）

R2A瓊脂培養基是一種檢測飲用水中微生物總數的培養基，具有低濃度的營養物質，用較低的培養溫度和較長的培養時間來刺激受損和耐氯微生物的生長。營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基等營養豐富的培養基，適合培養快速生長的微生物，但可能會抑制部分生長緩慢或受損的微生物。與這些培養基相比，R2A瓊脂培養基更有利于水中受損和耐氯微生物的生長[1]。本文通過對R2A瓊脂培養基平皿有效期的驗證，證明該培養基平皿在規定時間和貯存條件下，產品質量的穩定性適合生產所需。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉 [CMCC(F)98003]，購自中國食品藥品檢定研究所。注射用水，磷酸鹽標準緩沖液（pH 6.86）、硼砂標準緩沖液（pH 9.18）、氯化鈉、過濾器與濾膜由北京生物制品研究所有限責任公司提供。營養瓊脂培養基干粉、玫瑰紅鈉瓊脂培養基干粉由北京三藥科技開發公司提供。R2A瓊脂培養基干粉由美國BD公司提供。沙氏葡萄糖瓊脂培養基干粉由北京奧博星公司提供。

XG1.G型脈動真空蒸汽滅菌柜，山東新華有限公司；PHS-3D pH計，上海三信有限公司；ES-122P電子天平，北京湘平有限公司；masterclave 60培養基制備器、APSone90培養基分裝機，購自于法國梅里埃生物公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基平皿的制備

（1）R2A瓊脂培養基平皿。取18.5 g R2A瓊脂培養基干粉和1 000 mL注射用水置于培養基制備器中，執行121 ℃高壓滅菌15 min的程序，待降溫至42 ℃后在潔凈度以C+A的環境下（且符合該級別環境要求），連接培養基分裝器分裝平皿，測得培養基pH值在7.2±0.2的合格范圍內待用。

（2）營養瓊脂培養基平皿。取30 g 營養瓊脂培養基干粉加熱溶解于1 000 mL注射用水中，121 ℃高壓滅菌15 min，滅菌后pH值7.2±0.2，在潔凈度以C+A的環境下（且符合該級別環境要求）傾倒平皿，經無菌驗證及pH測定合格后待用[2]。

（3）玫瑰紅鈉瓊脂培養基平皿。稱取玫瑰紅鈉培養基干粉，加熱溶解于1 000 mL注射用水中，121 ℃高壓滅菌15 min，滅菌后pH值6.0±0.2，將培養基置于潔凈度以C+A的環境下（且符合該級別環境要求）傾倒平皿，經無菌驗證及pH測定合格后待用。

（4）0.9%氯化鈉溶液。將9 g NaCl溶于1 000 mL注射用水，攪拌溶解后除菌過濾，121 ℃高壓滅菌40 min后待用。

（5）沙氏葡萄糖瓊脂培養基平皿。稱取沙氏葡萄糖瓊脂培養基干粉，加熱溶解于注射用水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min，滅菌后pH值5.6±0.2，置于潔凈度以C+A的環境下（且符合該級別環境要求）傾倒平皿，經無菌驗證及pH測定合格后待用[2-3]。

1.2.2 菌懸液制備與菌種接種

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物接種至營養瓊脂培養基上，30～35 ℃培養18～24 h；將白色念球菌的新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，20～25 ℃培養24～48 h。以上菌種均需進行兩代傳菌后，用0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數小于100 CFU的菌懸液備用。將黑曲霉的新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，20～25 ℃培養5～7 d，進行兩代傳菌后的新鮮培養物加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨醇80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將胞子洗脫；然后，吸出胞子懸液至無菌試管內，用含0.05%（mL/mL）聚山梨醇80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含胞子數小于100 CFU的胞子懸液[3]。

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌制備成的菌懸液接種在R2A瓊脂培養基平皿和營養瓊脂培養基平皿上，置30～35 ℃溫房培養48 h后對計數結果進行數據分析。將白色念球菌與黑曲霉制備成的菌懸液接種在R2A瓊脂培養基平皿和玫瑰紅鈉瓊脂培養基平皿上，置23～28 ℃溫房培養72 h后對計數結果進行數據分析，每種菌各接種10個平皿計數。因黑曲霉菌落為片狀，無法在培養皿中計數，故用培養基平皿接種黑曲霉后的生長狀態照片來說明情況。

1.2.3 薄膜過濾法對工藝用水微生物的限度檢查

在理化指標上，注射用水（＜10 CFU/100 mL）對微生物要求要高于純化水（＜100 CFU/mL），故本次實驗選取注射用水進行微生物限度檢查，取已高壓蒸汽滅菌的0.25 μm孔徑的濾膜（直徑47 mm）、過濾器，將濾膜放在網盤上，組裝好濾器。將200 mL注射用水經濾器過濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于R2A、營養瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養基平皿上各5塊，置于30～35 ℃培養房中倒置培養5 d，計數濾膜上的菌落數（標準為逐日點計菌落數，菌落蔓延生長成片的平皿不計數），計算菌落檢出率并制表分析。

1.2.4 對R2A瓊脂培養基平皿進行培養基有效期的驗證

連續生產3個批次的R2A瓊脂培養基平皿，命名為 201703S001、201703S002、201703S003，每批次分別在0 d、30 d、60 d、90 d、100 d各取樣50塊進行質量檢測。如遇節假日，取樣可在計劃時間點內的±2 d施行。整個存放時間內，R2A瓊脂培養基存放環境的溫度應控制在18～25 ℃。檢定項目為培養基pH值、外觀、適用性（靈敏度）和無菌性檢查。平皿質量合格體現在4個參數上。（1）適用性：要求備檢培養基上的菌落平均數不少于對照培養基上的菌落平均數的70%；（2）pH值：滅菌后的pH值為7.2±0.2；（3）平皿外觀：無破裂，無裂紋，無明顯氣泡，無瓊脂凝塊；（4）無菌性：無染菌，無微生物生長。如在第100 d時樣品檢定時能達到以上的質量標準，則將R2A瓊脂培養基平皿的有效期規定為90 d。

適用性檢查：接種銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養瓊脂培養基上，30～35 ℃培養18～24 h，經兩代傳菌后，將上述培養物用0.9%氯化鈉溶液制成100 CFU/mL的菌懸液，備用。將兩種菌種稀釋好的菌懸液0.1 mL接種于實驗組的待檢培養基平皿和對照組的R2A瓊脂培養基上，然后用L-棒涂抹均勻，放置于30～35 ℃培養房中培養24～48 h后計數。

pH值的測定：對操作間溫度及pH計進行兩點法校正后，用純化水充分洗滌電極，吸盡水分，將pH電極頭插入樣品中，顯示值穩定后讀取pH值。

回收率計算：根據公式（1）計算回收率。

平皿外觀與無菌性觀察：將所生產平皿按比例（50∶1）進行留樣外觀及無菌性檢查，放于20～25 ℃培養房中倒置培養14 d。培養期間應逐日觀察并記錄是否有菌落生長，平皿外觀無菌性的結果由所拍攝的平皿樣品照片來表示。

1.3 重復性

用以上方法進行平行試驗3次。

1.4 數據分析

根據醫學統計學方法對適用性檢查數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 適用性檢查

由表1可知，R2A培養基與營養瓊脂培養基在接種銅綠假單胞菌與大腸埃希菌的3次實驗結果均有顯著差異（P≤0.05），接種在R2A培養基上的菌落數平均數高于營養瓊脂，說明R2A培養基在接種銅綠假單胞菌與大腸埃希菌的菌落長勢強于營養瓊脂培養基；R2A培養基與營養瓊脂培養基接種金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌的3次實驗結果均沒有顯著差異（P＞0.05），說明R2A培養基接種金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌的菌落長勢等同于營養瓊脂培養基。綜上所述，R2A培養基接種細菌微生物的效果均強于營養瓊脂培養基。

表1 R2A瓊脂培養基與營養瓊脂培養基P值比較

由表2可知，R2A培養基與玫瑰紅鈉瓊脂培養基在接種白色念球菌后3次結果均無顯著性差異（P＞0.05）[4]，說明R2A培養基在接種真菌微生物效果與玫瑰紅鈉瓊脂培養基相同。

由圖1可知，黑曲霉接種在玫瑰紅鈉瓊脂和R2A瓊脂培養基平皿上，在室溫23～28 ℃培養72 h，菌落開始為白色，柔軟有光澤，逐漸形成絨毛狀或絮狀絲狀菌落，培養7 d后菌落直徑可達2～3 cm，出現黑心，形成黑色的分生孢子頭。雖然黑曲霉在玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的長勢（形態和色澤）優于R2A瓊脂培養基，但這兩種培養基作為計數培養基，更側重于是否可以檢測出霉菌的數量，長勢不是本次試驗的目的。所以R2A瓊脂培養可替代玫瑰紅鈉瓊脂培養基應用于霉菌微生物的適用性檢查。

圖1 黑曲霉在玫瑰紅鈉、R2A瓊脂培養基上生長情況

綜上所述，R2A瓊脂培養基可替代營養瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養基應用于微生物的適用性檢查。

2.2 注射用水樣品微生物限度檢查

對注射用水微生物限度檢測結果用柱狀圖方法進行數據處理，得出如圖2所示結果：在3次平行試驗中，R2A瓊脂培養基在注射用水微生物限度檢測中檢出率均大于營養瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養基，說明R2A瓊脂培養基能夠替代營養瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養基應用于注射用水微生物限度檢查[5]。

圖2 平行3次實驗注射用水檢查平均數

2.3 靈敏度檢查

從圖3可看出，3批R2A培養基平皿中枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的回收率均超過70%。表3數據表明，這3批次被檢培養基滅菌后pH值均在合格范圍（7.2±0.2）內[3]。

表3 R2A瓊脂培養基平皿參數比較

圖3 枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌回收率

2.4 外觀與無菌性觀察

由圖4可知，平皿在制備后于18～25 ℃的常溫庫中培養100 d，外觀上無破裂，無裂紋，無明顯氣泡，無瓊脂凝塊；平皿在制備后于20～25 ℃的培養房中培養至100 d，無染菌現象。說明到第100 d時，樣品所需檢定項目均達到質量標準，所有R2A瓊脂培養基平皿的有效期規定為90 d。

圖4 平皿外觀與無菌性情況

R2A瓊脂培養基可取代營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基對工藝用水菌落總數的測定，與歐盟標準接軌，符合2015版《中華人民共和國藥典》要求。R2A瓊脂培養基平皿自制造之日至第100 d，外觀、pH值、無菌檢查、培養基適用性（靈敏度）檢查等項目結果均合格，可以滿足使用需求，依照R2A有效期驗證方案，將R2A瓊脂培養基平皿有效期規定為90 d。