維A酸對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用及分子機制分析

劉建林 李 惠 胡春艷 王慧超 呂心瑞

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)所致的慢性腎臟疾病，屬DM慢性微血管并發癥。尤其是近年來，隨著DM患病基數的不斷增長，DN患病人數也逐年上升，已成為終末期腎臟疾病(end stage of renal disease,ESRD)的主要病因之一，DN早期防治也已成為亟待解決的重要公共衛生課題。臨床試驗及動物實驗均證實腎小球纖維樣病變是DN腎臟病變進一步惡化的典型病理表現。抑制轉化生長因子β1(transforming growth factors-β,TGF-β1)過量表達是防治腎小球纖維化的關鍵。維A酸(retinoic acid,RA)是維生素A的中間代謝產物，研究已證實，組織RA在調節上皮細胞分化、胚胎生長、腫瘤發生中扮演重要角色，并能調節細胞凋亡、增殖及分化，但既往針對RA的臨床研究也多側重于腫瘤疾病、皮膚病等，在DN中的臨床報道相對鮮見?；诖?，本研究擬通過動物實驗分析RA對DN大鼠腎臟保護作用，并通過對TGF-β1通路及相關下游調控蛋白表達水平的測定探究其分子機制，旨在為DN的臨床防治提供方向，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級健康雄性大鼠及大鼠飼料均購自上海斯萊克動物實驗公司，質量200～250 g；動物飼養溫度23℃、濕度44%，自由攝食飲水，適應性喂養1周后開始實驗；高脂飼料為基礎飼料84.5%、蛋黃粉7%、豬油8%、膽酸鈉0.5%，由本實驗室自行配置。

1.1.2 試劑 放射免疫沉淀法裂解緩沖液(radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA裂解液)由實驗室自行配置[10%磷酸酶抑制劑∶1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)]；山羊抗兔IgG/HRP聚合物、DAB顯色試劑盒、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinase 9,MMP-9)試劑盒均購自北京中杉金橋有限公司；RA、鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、格列本脲購自美國Sigma化學公司；伊紅及蘇木素均購自BASO生物科技有限公司；尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血肌酐(serum creatinine, Scr)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Nephrin、Podocin、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、磷酸化p38MAPK(phosphorylated p38,p-p38MAPK)、TGF-β1、Caspase -3、Smad家族蛋白2/3(Smad2/3)、磷酸化Smad 2/3(p-Smad2/3)抗體購自英國Abcom公司。

1.1.3 儀器與設備 載玻片、蓋玻片均購自江蘇世泰實驗器材有限公司；石蠟切片機為Lecia RM 2135；脫水機為Leica TP1020；烤片機為安徽電子科學研究所QP-B；光學顯微鏡為日本OLYMPUS；蛋白電泳儀、電壓穩壓儀、蛋白轉印槽均購自美國Bio-Rad公司；7600 型全自動生化分析儀購自日本日立公司；染色玻璃缸購自上海鼎杰生物科技有限公司；血糖儀/試紙購自美國強生；酶標儀購自美國Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 60只SPF級大鼠隨機分為正常對照組、模型組、格列本脲組、RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組，每組10只；其中正常對照組、模型組給予5 mg/kg生理鹽水；格列本脲組按5 mg/kg給予格列本脲，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組分別按15 mg/kg、10 mg/kg、5 mg/kg給予RA；給藥方式為連續灌胃；按1次/天頻率持續給藥6周；6組大鼠均規律喂養普通飼料，自由飲水。每組大鼠數量不足10只則按隨機抽樣原則補齊動物并造模。

1.2.2 DN大鼠模型建立 SPD級大鼠適應性喂養一周后隨機分出10只作為正常組，余下大鼠參照文獻制作DN模型。造模大鼠禁食12 h，采用左腎切除術聯合高脂飼料喂養：0.1 mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液將STZ配置成2%溶液。4周后按60 mg/kg劑量經腹腔注射STZ，對照組則注射等劑量無菌枸櫞酸鈉緩沖液，給藥后72小時采集大鼠尾靜脈血，血糖儀測定血糖，連續3次隨機血糖(random blood glucose，RBG)≥16.7 mmol/L則提示DM大鼠造模成功(2只血糖未達標，棄用)；6周后24 h尿蛋白(urine protein,UP)>30 mg則提示DN大鼠造模成功(3只 24 h UP未表達，棄用)。

1.3 觀察指標

1.3.1 大鼠體質量及腎臟指數 實驗期間，按2周/次頻率給大鼠稱重，并測定空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)；待尿液采集、腹主動脈采血及稱重結束后處死大鼠，迅速取出腎臟，生理鹽水洗滌后吸干水分，去除包膜后稱腎質量，并計算腎臟指數(腎臟質量/體質量×1 000‰)，并將左腎浸泡于4%中性甲醛用于病理組織檢查；右腎則置于-80℃液氮后用于蛋白表達測定；記錄各組干預前、干預后第6周的體質量及干預后第6周的腎臟指數。

1.3.2 大鼠24 h尿蛋白含量、尿排泄量比較 于6周時在末次給藥結束前1 d用金屬代謝籠采集大鼠24 h尿液，記錄各組大鼠24 h總尿量、24 h尿蛋白含量、尿排泄量。

1.3.3 大鼠BUN、Scr、FBG 各組大鼠稱重后腹腔注射烏拉坦麻醉，腹主動脈采血并離心取血清，置于-20℃保存，全自動生化分析儀檢測血BUN、Scr、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)水平。

1.3.4 大鼠腎臟病理變化 取左腎，切成小塊后4%中性甲醛固定，蒸餾水洗滌組織后70%乙醇過夜，脫水、透明、石蠟包埋，切片、封片后HE染色，200倍鏡下觀察各組大鼠腎組織病理形態學變化，腎小球系膜有無增生、腎小管有無萎縮、腎間質有無炎癥細胞浸潤等。

1.3.5 大鼠腎組織TGF-β1 通路及相關下游調控蛋白表達水平 采用免疫印跡法(Western blotting法)測定Nephrin、Podocin、p38MAPK、p -p38MAPK、TGF -β1、Caspase -3、Smad2/3及p-Smad2/3 蛋白表達情況。取各組大鼠右腎組織，RIPA裂解液均漿后冰上孵育，4℃、12 000 r/min條件下離心20 min，BCA法對上清液進行蛋白定量，加上樣緩沖液制備樣本，取40 μg蛋白，12%SDS-PAGE凝膠電泳，而后轉至PVDF膜上，含5%BSA的TBST室溫封閉3～5 h，分別加入兔抗鼠抗體Nephrin、Podocin、p38MAPK、p -p38MAPK、TGF -β1、Caspase -3、Smad2/3及p-Smad2/3，比例分別為1∶1 000、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶200、1∶500、1∶1 000、1∶1 000，以β-actin(1∶2 000)為參照，4℃過夜；次日用含5%BSA的TBST洗膜5次，每次5 min，辣根過氧化物酶標記的II抗(1∶10 000)室溫孵育60 min后 TBST洗膜5次，每次5 min，ECL化學發光顯影；Image J軟件進行圖像分析，以光密度比值代表Nephrin、Podocin、p38MAPK、p-p38MAPK、TGF-β1、Caspase -3、Smad2/3、p-Smad2/3表達。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量及腎臟指數比較 模型組大鼠體質量下降(

P

<0.05)，其余各組大鼠體質量較入組時均上升(

P

<0.05)；與正常對照組比較，模型組大鼠體質量下降，而腎臟指數上升(

P

<0.05)；而與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組、格列本脲組大鼠體質量均上升(

P

<0.05)，腎臟指數下降(

P

<0.05)；RA高劑量組體質量高于RA中劑量組、RA低劑量組(

P

<0.05)，腎臟指數低于RA中劑量組、RA低劑量組(

P

<0.05)。各組體質量變化差值也有統計學意義(

P

<0.05)，與正常對照組比較，模型組體質量變化差值更低(

P

<0.05)；與模型組比較，格列本脲組、RA低劑量組、RA中劑量組、RA高劑量組體質量變化差值上升(

P

<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量及腎臟指數比較(n=10)

續表1

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白含量、尿排泄量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠24 h蛋白尿含量、尿排泄量均上升(

P

<0.05)；與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組、格列本脲組24 h蛋白尿含量、尿排泄量均下降(

P

<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白含量、尿排泄量比較(n=10)

2.3 各組大鼠BUN、Scr、FBG水平比較 與正常對照組比較，模型組大鼠BUN、Scr、FBG均上升(

P

<0.05)；而與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組、格列本脲組BUN、Scr、FBG均下降(

P

<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠BUN、Scr、FBG水平比較(n=10)

2.4 各組大鼠腎臟病理變化情況 HE染色可見正常對照組大鼠腎小球系膜未見增生現象，腎小管亦未見萎縮，腎間質無炎性細胞浸潤(見圖1A)；模型組大鼠則明顯可見腎小球系膜基質增多，部分腎小管有萎縮且存在管腔擴張，近端小管上皮細胞有糖原空泡，且腎間質可見灶狀慢性炎性細胞浸潤(見圖1B)；但格列本脲組和RA高、中、低劑量組大鼠腎小球基質均未見明顯增生，萎縮腎小管明顯減少(見圖1C-F)。

圖1 各組大鼠腎臟病理變化情況

2.5 各組大鼠腎組織TGF-β1 通路及相關下游調控蛋白表達水平比較 各組大鼠p38MAPK、Smad2/3表達水平比較，差異無統計學意義(

P

>0.05)；與正常組比較，模型組大鼠Nephrin、Podocin下降，p-p38MAPK、TGF-β1、Caspase-3、p-Smad2/3均上升；與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組的Nephrin、Podocin上升，p-p38MAPK、TGF-β1、Caspase-3、p-Smad2/3則下降，差異均有統計學意義(

P

<0.05)；其中RA高劑量組Nephrin、Podocin高于RA中劑量組、RA低劑量組(

P

<0.05),p-p38MAPK、TGF-β1、Caspase-3、p-Smad2/3則低于RA中劑量組、RA低劑量組，差異有統計學意義(

P

<0.05)。見表5、圖2。

表5 各組大鼠腎組織TGF-β1 通路及相關下游調控蛋白表達水平比較(n=10)

圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1 通路及相關下游調控蛋白表達水平(Western blotting實驗)

3 討論

DN的發病機制繁雜，當前研究指出，DN是長期高血糖與多種致病因素共同參與所致，以持續增加的尿蛋白排泄為典型臨床表現，并伴腎功能進行性下降,這在本次動物實驗中也有體現。本研究中，與正常對照組比較，模型組大鼠體質量顯著下降，而腎臟指數、24 h蛋白尿含量、尿排泄量、BUN、Scr、FBG則顯著上升；提示STZ可誘導腎臟腫脹、尿蛋白排泄增加及腎功能損傷，這與鐘艷花等的報道結論相似。但與模型組比較，本研究中RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組、格列本脲組大鼠體質量均顯著上升(

P

<0.05)，腎臟指數、24 h蛋白尿含量、尿排泄量、BUN、Scr、FBG顯著下降(

P

<0.05)。提示RA可改善STZ誘導的腎臟腫脹，并降低DN大鼠尿排泄量及尿蛋白，下調FBG，改善STZ誘導的腎功能損傷。同時，DN的典型病理表現為腎小球基底膜增厚、系膜區大量基質增生。本研究中，HE染色同樣可見正常對照組大鼠腎小球系膜未見增生現象，腎小管亦未見萎縮，腎間質無炎癥細胞浸潤；而模型組大鼠則明顯可見腎小球系膜基質增多，部分腎小管有萎縮且存在管腔擴張，近端小管上皮細胞有糖原空泡，且腎間質可見灶狀慢性炎性細胞浸潤；這與既往報道結論相符。但格列本脲組及RA高、中、低劑量組大鼠腎小球基質均未見明顯增生，萎縮腎小管明顯減少，這也在進一步印證RA可對DN大鼠發揮一定腎保護作用，并呈一定劑量依賴性。

Nephrin、Podocin均是敏感的足細胞特異性標志蛋白，其表達是維持足細胞結構、功能的關鍵蛋白。Wu等實驗也證實，DN存在Nephrin、Podocin異常表達，并促進蛋白尿發生、發展及腎小球硬化。同時，臨床研究還指出，TGF-β通過TGF-β1型受體進行信號轉導后，激活Smad2、Smad3并磷酸化，與Smad4形成異源三聚體復合物易位入核，將信號從細胞表面傳導至細胞核，調節靶基因功能；在激活Smad通路的同時，也激活p38MAPK通路，進一步活化Caspase -3引起足細胞凋亡。且TGF -β1、Caspase -3所介導腎臟氧化應激反應也可進一步促進足細胞凋亡[18]。因此，抑制TGF -β1/Smads/p38MAPK信號轉導通路于DN防治至關重要。為探究RA的腎保護機制，本研究比較各組腎組織TGF-β1 通路及相關下游調控蛋白表達水平。結果顯示，各組大鼠p38MAPK、Smad2/3表達差異無統計學意義；與正常組比較，模型組大鼠Nephrin、Podocin顯著下降，p -p38MAPK、TGF -β1、 Caspase -3、 Smad2/3均顯著上升；但與模型組比較，RA高劑量組、RA中劑量組、RA低劑量組的Nephrin、Podocin顯著上升，p -p38MAPK、TGF -β1、 Caspase -3、 Smad2/3則顯著下降。提示RA可有效提升DN大鼠腎組織足細胞蛋白Nephrin、Podocin表達，降低TGF -β1、Caspase -3蛋白表達，并抑制p38MAPK磷酸化及Smad2/3活性，從而抑制足細胞凋亡、改善腎小球硬化，最終改善DN大鼠腎功能及腎組織病理變化，發揮腎保護作用。

綜上所述，RA可通過抑制TGF -β1/Smads/p38MAPK信號轉導通路改善DN大鼠腎臟腫脹，降低其排尿量及尿蛋白，改善腎功能，發揮腎保護作用，并呈一定劑量依賴性。但本研究也存在一定局限性，著重探究了RA對DN大鼠腎功能的影響及機制，其對DN大鼠血糖的改善機制尚不明確，擬作為下階段研究目標，持續補充及完善。