宮頸細胞蠟塊制作方法在宮頸病變篩查中的比較研究

蘇訥敏，易馳喆，黃靈泉，張雪梅

（柳州市工人醫院病理科，廣西 柳州 545005）

子宮頸癌（cervical cancer）是婦科常見的惡性腫瘤，也是威脅亞洲婦女健康的第2 大惡性腫瘤[1]。宮頸液基細胞學檢查方法的出現，為宮頸癌癌前病變及早癌篩查提供了重要手段。然而，液基細胞學檢測易受主觀影響，部分患者可能因非典型鱗狀細胞（ASC-UC）被漏診或因過度診斷而被分流至不必要的活檢檢查[2，3]，對其身體及心理均造成一定影響。研究顯示[4]，利用宮頸液基細胞學標本制作成細胞蠟塊能夠有效收集細胞，對于液基細胞學可疑陽性的病例進一步進行免疫組化檢測，可以協助提高診斷的準確性，為臨床進一步分流患者提供可靠的依據[5-7]。傳統的瓊脂包埋法[8]是常用的細胞蠟塊制作方法，顧維娜等[9]在傳統方法的基礎上進行改良，使細胞更加集中，通過放入溫箱使瓊脂凝固，取得了較好的制片效果（以下稱瓊脂溫箱凝固包埋法），本研究在兩者的基礎上，優化凝固條件，保持細胞集中平鋪，簡化流程，旨在為后續的免疫組化及分子病理檢測提供可能，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集柳州市工人醫院病理科2018 年1月～12 月經宮頸液基細胞學檢查（TCT）剩余細胞學標本270例，其中經組織活檢診斷為炎癥、低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）、高級別鱗狀上皮內病變（HSIL），鱗狀細胞癌（SCC）的病例分別為148例、35例、72例、15例。

1.2 方法 將檢測剩余的宮頸液基細胞樣本平均分為3 份，倒入對應編號的離心管中，以2000 rpm 離心10 min 收集細胞，分別用傳統瓊脂包埋法、瓊脂溫箱凝固包埋法、瓊脂冷凍凝固包埋法進行細胞蠟塊制備。3 種細胞蠟塊制備完成后均進行常規切片，HE 染色，由2 位高年資病理醫師共同閱片診斷。

1.2.1 傳統瓊脂包埋法 用吸管吸取上清液棄掉；取60 ℃3%瓊脂1 滴滴入離心管中，搖動使瓊脂與細胞充分混合，將離心管置于4 ℃冰箱20 min；待混合液呈凝膠狀后取出，用包埋紙包好，按常規石蠟包埋制作細胞蠟塊。

1.2.2 瓊脂溫箱凝固包埋法[9]用吸管吸去大部分上清液，余留高于沉渣1 cm 的液體，混勻細胞懸液；將一滴60 ℃3%的瓊脂滴在胃鏡包埋盒的小槽中，使瓊脂均勻鋪滿小槽內，并置于60 ℃溫箱2 min；吸取全部細胞懸液于包埋盒的小槽，放置溫箱4 min；待細胞沉渣凸面變為凹面時，在胃鏡包埋盒的小槽內再次滴加瓊脂，直至覆蓋沉渣表面少許，再次將包埋盒放入溫箱2 min；包埋盒置于冰箱冷凍倉冷凍3 min后，將瓊脂塊取出，用包埋紙包好，按照常規石蠟包埋制備細胞蠟塊。

1.2.3 瓊脂冷凍凝固包埋法 吸取1 滴滴入60 ℃3%的瓊脂滴在小號包埋盒中，使瓊脂均勻平鋪于包埋盒，置于冰箱冷凍倉3 min，使瓊脂凝固；用吸管吸去離心管上清液，將細胞沉渣吸出盡可能平鋪于凝固的瓊脂中心后在包埋盒中再次滴加瓊脂至剛好覆蓋沉渣完全，包埋盒放入冰箱冷凍倉3 min 后，將瓊脂塊取出，按照常規石蠟包埋制備細胞蠟塊。

1.3 觀察指標及評價標準 比較3 種方法制片效果、診斷陽性率及診斷的符合率。細胞學：參照《子宮頸細胞學Bethesda 報告系統》（第2 版）標準。組織學：依據2014 年第4 版WHO 女性生殖器官腫瘤分類標準分為：炎癥、低級別低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）、高級別鱗狀上皮內病變（HSIL）及鱗狀細胞癌（SCC）。以活檢組織學診斷為金標準，以發現高級別鱗狀上皮內病變及鱗狀細胞癌為陽性。

1.4 統計學方法 數據使用SPSS 19.0 軟件分析，計數資料使用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蠟塊及切片制作效果

2.1.1 肉眼觀察 利用傳統瓊脂包埋法制作的細胞蠟塊因細胞與瓊脂混雜，細胞較分散，肉眼觀組織輪廓不清晰，瓊脂溫箱凝固包埋法及瓊脂冷凍凝固包埋法所制的細胞蠟塊因細胞沉渣被瓊脂包裹于中心，細胞較集中，組織輪廓清晰，見圖1。

2.1.2 顯微鏡下觀察 傳統瓊脂包埋法細胞較分散，背景混雜瓊脂無定型物，每張切片能夠觀察到的細胞較少，另外兩種方法制成的切片細胞相對集中，觀察細胞數量較多，其中瓊脂冷凍凝固包埋法較瓊脂溫箱凝固包埋法細胞更加集中和平鋪，所觀察的細胞數也更多，見圖2。

圖1 三種細胞蠟塊制備方法蠟塊及切片肉眼觀

圖2 三種細胞蠟塊制備方法的HE 染色切片顯微鏡下形態

2.2 操作過程及用時 傳統瓊脂包埋法操作簡單，但瓊脂及細胞混合物凝固時間較后2 種長；瓊脂冷凍凝固法相對瓊脂溫箱凝固法操作步驟簡單，用時較短。

2.3 篩查陽性率及診斷符合率 3 種方法每組各270例標本，細胞蠟塊制作均滿意，TCT 及3 種細胞蠟塊制備法診斷陽性率分別為25.92%（70/270）、24.44%（66/270）、27.41%（74/270）、30.00%（81/270），3 種細胞蠟塊制備方法診斷陽性率分別與TCT 結果相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；3 種方法與其診斷符合率分別為86.67%（234/270）、92.59%（250/270）、95.93%（259/270），與后2 種細胞蠟塊制備法相比，傳統瓊脂包埋法診斷符合率較低，差異有統計學意義（P＜0.05），瓊脂溫箱凝固包埋法與瓊脂冷凍凝固包埋法與組織病理診斷符合率較高，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 TCT、三種細胞蠟塊制備法以及組織活檢結果（n）

3 討論

目前對于宮頸癌前病變的篩查最常用的方法是液基細胞學檢查，因其取材簡單，操作方便，易于觀察被臨床廣泛使用[10]，然而對于部分可疑陽性的病例，臨床處理過程中，部分患者被建議3～6 個月后復查，部分被分流至宮頸活檢及進一步行免疫組化檢測協助診斷，極易漏診或過度處理[11]，同時對患者身心都造成一定影響，因此有必要探索一種既能在早期提高宮頸病變篩查的準確率，又操作簡單便捷的方法，如何充分有效利用細胞學標本顯得尤為重要。液基細胞的保存有一定的時限性，且需要耗費的資源及成本較高，研究顯示細胞蠟塊技術可彌補這一缺陷，并且有助于提高細胞病理學診斷的敏感性和特異性[12]。將TCT 剩余標本制作成細胞蠟塊，能夠收集更多刷取的脫落細胞，實現組織學重構，便于反復、連續切片，并為進一步免疫組化及分子檢測提供可能，為細胞學診斷提供更多依據，大提高了細胞學診斷及分流的時效性及可能性。

宮頸液基細胞不同于胸腹水具有纖維蛋白網羅細胞的功能，宮頸液基細胞標本細胞含量較少且較為松散，制作細胞蠟塊時細胞沉渣的收集及取出比較困難。文獻報道的傳統瓊脂包埋法[8]是在離心管內滴加瓊脂，將細胞沉渣及瓊脂混合后取出混合物。本研究發現在滴加瓊脂的過程中，細胞沉渣被瓊脂沖散，瓊脂與細胞混合物不易成形、細胞分散、不易成團、切片時細胞難以處于同一平面，導致可觀察的細胞數較少，同時鏡下易出現瓊脂無定型物背景，影響觀察及診斷。顧維娜等[9]報道的瓊脂溫箱凝固包埋法相比傳統瓊脂包埋法，采用瓊脂上下包裹細胞，使細胞聚集在一定范圍內，易于觀察切片。然而本研究發現采用溫箱蒸發凝固胃鏡包埋盒中平鋪的瓊脂時，由于水分的蒸發，瓊脂表面會凹凸不平，局部下陷，再將細胞放入瓊脂表面時，也將造成細胞分布層次不一，影響切片觀察，并且整個操作過程步驟較多，較費時。

本研究在上述瓊脂溫箱凝固包埋法的基礎上，經過改良，優先快速冷凍凝固底層瓊脂使其產生一個平面，將細胞沉渣平鋪于瓊脂平面上，保證了細胞團塊的集中和平整，有利于切片，可以減少蠟塊修整導致的細胞含量損失，后將表層瓊脂覆蓋并快速冷凍凝固，易于將瓊脂塊整體取出，切片后細胞量多，集中、平鋪，制片效果好，且操作過程簡單省時，是一種較好的宮頸細胞蠟塊制備方法。

對細胞蠟塊診斷數據分析顯示：TCT 及3 種細胞蠟塊制備法診斷陽性率分別為25.92%、24.44%、27.41%及30.00%，差異無統計學意義（P＞0.05），提示細胞蠟塊對于宮頸病變篩查陽性率與TCT 結果相仿，可以作為除TCT 外的選擇，并通過后續免疫組化及分子病理檢測進一步對病變進行分流，這一結論與朱勇等[12]的研究結果一致。此外，與后2 種細胞蠟塊制備法相比，傳統瓊脂包埋法與組織活檢診斷符合率較低，瓊脂溫箱凝固包埋法與瓊脂冷凍凝固包埋法與組織病理診斷符合率較高，差異無統計學意義（P＞0.05），提示經過改良后的2 種瓊脂凝固包埋法均較傳統瓊脂包埋法有助于提高診斷的準確率，雖然2 種改良后的方法在診斷準確率上無明顯差異，但瓊脂冷凍凝固包埋法在操作便捷及用時方面優于瓊脂溫箱凝固包埋法。

綜上所述，可以考慮將宮頸液基細胞蠟塊制備技術作為TCT 替代方案，不僅可以提高早期宮頸病變篩查的準確性，同時也為部分需要進一步明確診斷的患者提供了檢測機會，如通過對細胞蠟塊P16及Ki-67 表達情況可以早期發現宮頸高級別上皮內病變，避免不必要的創傷性活檢及漏診，為患者節約了檢測成本，減輕了患者身心負擔。瓊脂冷凍凝固包埋法是一種較好的宮頸細胞蠟塊制備方法。