兩種可吸收生物膜聯合去蛋白牛骨基質植入犬拔牙窩成骨的影像學評價

王思雯，尤鵬越，劉玉華，王新知，唐 琳，王 梅

(北京大學口腔醫學院·口腔醫院，修復科 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室 口腔數字醫學北京市重點實驗室，北京 100081)

近年來，種植修復技術作為修復牙齒缺失的方法已得到越來越廣泛的臨床應用，然而種植體植入位點的骨量不足及骨質不佳極大影響了種植體植入的成功率以及長期存活率[1-2]。以往研究表明，在拔牙后的3年內，自然愈合的拔牙窩牙槽骨吸收量可達40%～60%[3]。在拔牙窩內的血凝塊形成后，上皮和結締組織會優先長入拔牙窩內，從而對骨組織的形成產生競爭性抑制[4]。引導性骨再生技術(guided bone regeneration, GBR)通過在骨缺損上覆蓋屏障膜，阻止缺損周圍的成纖維細胞和上皮細胞快速長入，既保護了血凝塊，也為成骨細胞的遷移、增殖和分化提供一個穩定的環境，對促進骨缺損區域新骨形成有重要作用[5]。有研究表明，在拔牙同期采用屏障膜和/或骨移植材料的GBR技術能夠減少牙槽骨的吸收，從而實現硬組織的保存，減少后續種植手術的風險[6]。

目前，臨床上在拔牙后GBR技術中應用最為廣泛的屏障膜是豬膠原來源可吸收生物膜Bio-Gide?(簡稱Bio-Gide膜)，已有大量實驗研究證實了其應用效果[7-8]。研究者們仍致力于開發降解時間更長、機械性能更強的可吸收生物膜，以保證膜材料在具有良好的生物相容性的情況下，能夠進一步穩定成骨空間，達到更佳的骨修復效果。

豬小腸黏膜下層(small intestinal submucosa, SIS)是一種細胞外基質(extracellular matrix, ECM)材料，具有天然的三維支架結構，并且含有糖蛋白、糖胺聚糖和各種生長因子，對促進骨再生有積極的效果。目前已有小型動物實驗證明，應用SIS膜修復骨缺損達到的骨再生程度與Bio-Gide膜類似[9]，且SIS膜比Bio-Gide膜具有更長的降解周期和更優的機械性能[10]，有望達到更佳的引導性骨再生效果。

本研究將復層豬小腸黏膜下層膜(multilamina-ted SIS, 簡稱mSIS膜)和Bio-Gide膜聯合去蛋白牛骨基質應用于犬拔牙窩模型，并采用微計算機體層掃描(micro-computed tomograph, Micro-CT)方法評價拔牙窩內骨再生的效果。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

實驗材料和試劑主要有：復層豬小腸黏膜下層(北京大清生物技術股份有限公司，中國)、Bio-Gide?可吸收生物膜(Geistlich公司，瑞士)、Bio-Gide?去蛋白牛骨基質骨替代材料(0.25～1.00 mm顆粒，Geistlich公司，瑞士)、戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國)、青霉素鈉(80萬單位，華北制藥股份有限公司，中國)。

1.2 實驗動物及倫理

3只比格犬，年齡18～24個月，體質量12.1～14.5 kg，檢疫合格，于軍事科學院實驗動物中心動物房飼養。所有犬在實驗全程進食軟食，自由飲水，適應性飼養至少1周后進行實驗。本實驗經北京大學生物醫學倫理委員會批準(批準號：LA2018293)。

1.3 實驗分組

3只實驗用犬隨機編號為1～3號，選擇雙側上下頜前磨牙區域為術區，其中一側上下頜在距離動物處死前12周進行實驗操作，另一側在動物處死前4周進行實驗操作。拔除每只動物上頜第二和第三前磨牙，以及下頜第二至第四前磨牙的遠中部分，得到前磨牙遠中拔牙窩。在每一側的5個拔牙窩中隨機選取3個拔牙窩用于本實驗，4周、12周時各有9個拔牙窩，平均隨機分為以下3組，每組3個重復拔牙窩：(1)mSIS組，拔牙窩內植入Bio-Oss骨粉并覆蓋mSIS膜；(2)BG組，拔牙窩內植入Bio-Oss骨粉并覆蓋Bio-Gide膜；(3)空白對照組，拔牙窩自然愈合。各組拔牙窩處理方法見圖1。

A, mSIS group, sockets filled with Bio-Oss and covered by mSIS; B, BG group, sockets filled with Bio-Oss and covered by Bio-Gide; C, blank control group, no treatment. mSIS, multilaminated small intestinal submucosa membrane.圖1 各組拔牙窩的處理方法Figure 1 Schematic representation of the treatment of all groups

1.4 實驗方法

按1 mL/kg的劑量靜脈注射3%(體積分數)戊巴比妥鈉對實驗動物進行全身麻醉，至動物角膜反射消失。手術步驟如圖2所示，采用2%(體積分數)碘伏消毒口周，暴露動物一側上下頜前磨牙區(圖2A)，采用0.12%(體積分數)氯己定溶液消毒口內。使用牙齦分離器對前磨牙頰舌側牙齦分齦，翻開牙齒頰舌側黏膜全厚瓣達膜齦聯合處。在大量冷卻生理鹽水的沖洗下，使用渦輪機將前磨牙沿頰舌向半切達根分歧處(圖2B)。對前磨牙近中根進行根管治療和樹脂充填，并拔除遠中根(圖2C)。取mSIS膜和Bio-Gide膜修剪其長寬至適合拔牙窩大小，將膜的一端伸入拔牙窩舌側骨板和牙齦之間，將已在無菌生理鹽水中浸潤5 min的Bio-Oss骨粉植入并填滿整個拔牙窩(圖2D)，再將膜的另一端伸入拔牙窩的頰側骨板與牙齦之間至覆蓋整個拔牙窩(圖2E)。無張力復位齦瓣，使用5-0可吸收線間斷縫合傷口(圖2F)。在該側實驗完成后(12周組)，于8周后對同一只動物的另一側上下頜進行實驗(4周組)，操作步驟同上。

A, preoperative photograph; B, teeth were hemisected; C, distal roots were extracted; D, the sockets were filled with Bio-Oss; E, the sockets were covered by membranes; F, primary closure of the sites.圖2 手術步驟Figure 2 Clinical view of the surgical procedures

術后連續3天給予實驗動物肌肉注射80萬單位青霉素鈉，予0.12%氯己定溶液口腔沖洗(每周2次)。術后密切觀察實驗動物狀態及飲食情況，并檢查術區傷口愈合情況，之后每周定期對動物進行全身狀態觀察以及術區檢查。

1.5 標本獲取

于每只實驗動物最后一次手術4周后采用3%戊巴比妥鈉靜脈注射再次麻醉動物，并行空氣栓塞法處死。截取上頜第二和第三前磨牙區域，以及下頜第二至第四前磨牙區頜骨組織獲取標本，10%(體積分數)中性甲醛緩沖溶液固定。

1.6 Micro-CT檢測

于北京大學口腔醫院中心實驗室對所有標本進行Micro-CT掃描，檢查系統為SIEMENS INVEON。掃描條件為：電壓80 kV，電流500 μA，曝光時間1 000 ms，有效體素 13.18 μm，將標本旋轉360°進行掃描。

使用軟件Inveon Research Workplace 4.2對得到的數據進行分析，在General Analysis中圈選牙槽窩區域。通過調整新生骨灰度值范圍使其覆蓋新生骨區域，并計算整個牙槽窩內的新生骨容積比例(bone volume fraction, BV/TV)和新生骨密度(bone mineral density, BMD)。然后以牙槽窩近遠中牙槽嵴頂部連線為牙槽窩冠方邊緣，以牙槽窩根尖為根方邊緣，將牙槽窩劃分為冠1/3、中1/3和根1/3三個部分，分別計算各區域的新生骨容積比例(BV/TV-1、BV/TV-2、BV/TV-3)。通過骨形態學分析，計算得到牙槽窩內新生骨的骨小梁數量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁分離度(trabecular spacing, Tb.Sp)以及骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)。

1.7 統計學分析

采用ANOVA單因素方差分析對實驗所得數據進行分析，統計數據以每組的平均值±標準差表示，采用IBM SPSS 22.0(SPSS Inc，Chicago IL，USA)軟件，檢驗數據復合正態性和方差齊性后，行ANOVA單因素方差分析，組間比較采用Post Hoc的LSD分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

手術后1周內對動物進行全身情況以及術區情況檢查，所有動物精神狀態良好，活動自如，飲食正常，術區傷口正常愈合，未出現傷口裂開和感染。

2.1 Micro-CT圖像觀察

選取Micro-CT圖像中各實驗組拔牙窩的冠狀面、矢狀面圖以及水平面截圖進行觀察(圖3、4)。

mSIS, multilaminated small intestinal submucosa membrane; BG, Bio-Gide; Micro-CT, micro-computed tomography.圖3 術后4周牙槽窩新生骨Micro-CT圖像(黃色箭頭示新生骨，綠色箭頭示骨移植材料)Figure 3 Micro-CT images at 4 weeks of healing showing new bone (yellow arrows) and bone substitute materials (green arrows)

Abbreviations as in Figure 3.圖4 術后12周牙槽窩新生骨Micro-CT圖像(黃色箭頭示新生骨，綠色箭頭示骨移植材料)Figure 4 Micro-CT images at 12 weeks of healing showing new bone (yellow arrows) and bone substitute materials (green arrows)

術后4周時，空白對照組拔牙窩內可見由四周骨壁向拔牙窩中心生長的新生骨組織，骨小梁結構清晰，中心區域為大面積低密度影像，拔牙窩中央及齦方空虛，缺少新骨充填。mSIS組及BG組在牙槽窩內可見高密度影像的骨移植材料，顆粒狀不規則形態的骨粉顆粒填充滿整個牙槽窩，新生骨組織不僅見于牙槽窩四壁，還圍繞骨粉顆粒大量存在，密度低于骨粉，與四周骨壁有明顯的界限。除了骨粉及新骨，牙槽窩內仍可見小面積的低密度骨髓腔存在。

術后12周時，空白對照組拔牙窩中央仍有大面積空虛區域，四周的新生骨組織與骨壁邊界不清，可見少量骨小梁。mSIS和BG組拔牙窩內的新生骨組織密度較術后4周時有明顯增加，與四周骨壁已無明顯界限，大量的新生骨組織包繞骨粉并充滿整個拔牙窩。

2.2 Micro-CT定量分析

計算各組在各時間點牙槽窩內新生骨的BV/TV，結果見表1～2。mSIS組和BG組在術后4周和12周整個牙槽窩內的BV/TV均顯著高于對照組(P<0.05)，而mSIS組略好于BG組，但兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

mSIS組和BG組在各時間點的冠1/3、中1/3和根1/3的新生骨容積比例(BV/TV-1、BV/TV-2、BV/TV-3)均顯著高于空白對照組(P<0.05)，mSIS組和BG組間差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 術后4周及12周各組牙槽窩內新生骨容積比例Table 1 New bone fraction of all groups at

術后4周時，mSIS組和BG組的BV/TV-1顯著高于BV/TV-2和BV/TV-3(P<0.05)，空白對照組牙槽窩各區域間BV/TV的差異無統計學意義(P>0.05)。術后12周時，各組的BV/TV-1均高于BV/TV-2和BV/TV-3，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 術后4周及12周各組牙槽窩內分區域的新生骨容積比例Table 2 New bone fraction of all groups in coronal, middle and apical third of the socket at 4 and 12 weeks (%,

各組在各時間點牙槽窩內新生骨密度的結果如表3所示。術后4周，mSIS組、BG組和對照組的新生骨密度值接近，各組間差異無統計學意義(P>0.05)。術后12周，mSIS組和BG組的新生骨密度值顯著高于對照組(P<0.05)，mSIS組略高于BG組，但兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 術后4周、12周各組牙槽窩內新生骨密度Table 3 Bone mineral density of all groups at

對各組Micro-CT數據進行骨形態學分析，術后4周及12周的Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th如表4所示。mSIS組和BG組在術后4周和12周時的Tb.N顯著高于對照組(P<0.001)，mSIS組略好于BG組，但兩組間差異均無統計學意義(P>0.05)。mSIS組和BG組術后4周和12周的Tb.Sp值顯著低于對照組(P<0.05)，mSIS組與BG組間的差異無統計學意義(P>0.05)。術后4周和12周各實驗組之間Tb.Th的差異均無統計學意義(P>0.05)。

表4 術后4周及12周各組牙槽窩內骨形態學分析Table 4 Bone morphometric analysis of all groups at

3 討論

臨床上，維持牙齒拔除后牙槽骨充足的骨量與骨質是種植修復技術成功的關鍵之一。犬在骨組織成分和骨質結構上與人體具有一定的相似性[11]，其上下頜骨結構也較接近人體的解剖構造。相較于小型實驗動物，犬的上下頜骨能夠更好地建立模擬人體的拔牙窩模型。由于犬上下頜前磨牙區域牙齒數量較多且牙齒大小相差較小，是制造拔牙窩常選擇的實驗位點。研究者們為了模擬臨床上單顆牙齒缺失時的情形，選擇拔除前磨牙的遠中根并保留近中根，建立間隔拔牙窩模型[12-13]。本實驗參考既往研究，將前磨牙分根后的遠中部分拔除，對于出現牙髓暴露的近中部分，采取了根管治療的處理方法，消除了可能的牙髓炎癥對遠中拔牙窩實驗位點的影響。

維持拔牙窩內穩定的成骨空間對新骨再生非常重要。在引導性骨再生技術中，屏障膜不僅需要阻止骨缺損周圍纖維結締組織的快速長入，還要承受覆蓋在缺損上方軟組織的壓力，防止成骨空間的塌陷。本研究采用的mSIS膜由8層單層的SIS膜復合而成，彌補了單層SIS膜機械性能較差且易塌陷的問題[9]。將mSIS膜或Bio-Gide膜覆蓋于植入Bio-Oss骨粉的拔牙窩上，可觀察到骨粉顆粒穩定存在于拔牙窩內，在愈合過程中，拔牙窩的冠方表面略有凸起，而自然愈合的空白對照組牙槽窩表面呈凹陷狀。Bio-Gide膜聯合Bio-Oss骨粉顆粒是一種較經典的修復骨缺損的方法，已在臨床上得到了廣泛的應用[14-15]。本研究中，BG組4周和12周的BV/TV值分別為40.34%和53.09%，與Kim等[8]和Wang等[16]的研究結果接近。mSIS組在術后4周和12周的BV/TV值分別為41.10%和58.04%，該數值顯著高于空白對照組，與BG組的數值無明顯差異。Turri等[17]的研究發現，使用SIS膜修復的骨缺損其新生骨比例高于自然愈合組，且高出的部分主要集中在靠近膜的缺損頂部，本研究也觀察到了相似的實驗結果，術后4周mSIS組和BG組的牙槽窩冠1/3區域的新生骨百分比顯著高于其余兩個區域。屏障膜的覆蓋使缺損區域中靠近膜的部分在愈合早期即出現新生骨組織，使缺損頂部由屏障膜支撐變為新生骨和屏障膜共同支撐，有利于后續成骨空間的穩定。新生骨BMD代表新生骨組織的礦化程度，術后4周時各實驗組之間的結果無顯著差異，術后12周時mSIS組和BG組數值已顯著高于空白對照組，也表明更好的成骨環境對新生骨組織的礦化有積極的作用。

Micro-CT骨形態學分析中的骨小梁數量、骨小梁分離度以及骨小梁厚度，是代表新生骨小梁微觀結構的重要指標[18]。Tb.N和Tb.Th的數值越高，代表新生骨小梁越成熟；Tb.Sp的數值越低，表明骨小梁之間的間距越小，代表骨小梁排列的越緊密。良好的骨小梁形態排列及結構對于骨組織愈合的穩定性以及骨的質量有著重要意義[18]。本研究中術后4周、12周各實驗組的Tb.Th值接近，但mSIS組和BG組的Tb.N值均顯著高于空白對照組，表明在形成的新生骨小梁厚度接近的情況下，覆蓋mSIS或Bio-Gide膜的牙槽窩內新生骨小梁數量更多，這與Kim等[8]、Leventis等[19]、Sun等[20]的研究結果一致，也印證了mSIS組和BG組的BV/TV更高的實驗結果。術后4周及12周mSIS組和BG組的Tb.Sp值均遠低于對照組，這與Wu等[9]的研究結果一致，可能代表經過mSIS膜和Bio-Gide膜覆蓋處理的拔牙窩骨再生后的新骨骨質更佳。Omar等[21]發現，屏障膜在引導性骨再生技術中不只承擔被動屏障的角色，還能在骨再生的過程中起到生物活性屏障的作用。Turri等[17]的研究發現，覆蓋于缺損上的SIS膜能夠吸引不同表型的細胞，并促進細胞順序表達和分泌與骨再生和重塑相關的因子和信號，在新骨形成和骨成熟的過程中起重要作用，這可能與覆蓋mSIS膜的實驗組牙槽窩內新生骨骨質更佳相關。

綜上所述，mSIS膜作為屏障膜能夠促進犬新鮮拔牙窩內的新骨形成，在新生骨組織的骨量與骨質上，mSIS膜與Bio-Gide膜的應用效果類似，是一種具有臨床應用前景的屏障膜材料。