玉米穗軸粗全基因組關聯分析

馬 娟 曹言勇 李會勇

玉米穗軸粗全基因組關聯分析

馬 娟 曹言勇 李會勇*

河南省農業科學院糧食作物研究所, 河南鄭州 450002

玉米穗軸粗是一個影響玉米產量和穗軸產量的重要性狀, 其遺傳機制的解析可以對高產育種提供指導。本研究以309份玉米自交系為材料, 利用測序基因型分型技術對其進行基因型鑒定。采用FarmCPU (fixed and random model circulating probability unification)、MLMM (multiple loci mixed linear model)和CMLM (compressed mixed linear model)方法, 對2017年和2019年河南原陽、河南鄲城、河南虞城、海南三亞以及最佳線性無偏估計值環境的穗軸粗, 進行全基因組關聯分析, 共鑒定12個與穗軸粗顯著關聯的SNP (single nucleotide polymorphisms) (<8.60E-07)。其中, S4_29277313利用FarmCPU和MLMM方法在2017年原陽均檢測到。S1_29006330、S2_170889116、S2_2046026464和S4_83821463的表型變異解釋率介于10.23%~14.17%, 為主效SNP。而且, S1_29006330位于已定位的穗軸粗QTL (quantitative trait loci)區間內。共挖掘17個候選基因, 其中(wall-associated receptor kinase-like 14)、轉錄因子(zinc-finger protein expressed in inflorescence meristem 35)、(HMG-Y-related protein A)、組蛋白-賴氨酸N甲基轉移酶(trithorax 4)和(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 32), 可能是影響穗軸粗的重要基因。挖掘的4個穗軸粗主效SNP和5個候選基因可以為分子標記輔助育種、精細定位和基因克隆提供信息。

玉米; 全基因組關聯分析; FarmCPU; 穗軸粗

玉米穗軸粗是一個重要的穗部性狀, 與玉米產量相關性狀具有密切關系。穗軸粗與穗粗具有顯著正相關關系, 相關系數高達0.57~0.77[1-4], 與穗行數表現為中度極顯著正相關(= 0.41~0.45,<0.01)[1-2,5]。此外, 穗軸粗與單穗粒重(= 0.21~0.39)[2-3,6]、穗長(= 0.34~0.36)[1,4]、行粒數(= 0.25)[1]、單穗重(= 0.21~0.22)[1,4]、粒長(= 0.27)[4]、粒寬(= 0.17~0.23)[4]和粒厚(= 0.20)[2]也表現出顯著正相關。玉米穗軸同時作為重要的工業原材料, 可以用來制備生物燃料纖維素乙醇[7], 在可持續能源發展中具有重要作用。穗軸粗是影響穗軸的一個重要性狀, 與穗軸重存在較高正相關關系(= 0.58~ 0.61,<0.01)[1-2]。因此, 解析玉米穗軸粗的遺傳機制, 對玉米產量和穗軸產量的提高均具有重要意義。

數量性狀定位和全基因組關聯分析(genome-wide association study, GWAS)是解析穗軸粗遺傳構成的重要方法。Yi等[8]利用RIL (recombinant inbred line)群體和永久F2群體共鑒定13個控制穗軸粗的數量性狀位點(quantitative trait loci, QTL), 其解釋表型變異率為4.3%~8.7%。Guo等[2]利用鄭58×昌7-2構成的231個F2:3家系在2個密度條件下挖掘13個穗軸粗QTL, 其中3個QTL的表型變異解釋率為13.65%~24.71%, 為控制穗軸粗的主效QTL。Choe等[1]利用韓國糯玉米構成的F2:3群體鑒定到7個控制穗軸粗的QTL, 解釋表型變異率為4.4%~12.9%。王幫太等[9]通過元分析(meta-analysis)整合了產量相關性狀QTL, 發現穗軸粗存在5個一致性QTL, 其中, 2個Meta-QTL在籽粒產量的2個區域中出現。Su等[3]利用復合區間作圖和最小絕對值收斂和選擇算子分別鑒定2個和3個穗軸粗QTL。Zhu等[4]利用全基因組關聯分析挖掘到5個穗軸粗顯著關聯SNP (single nucleotide polymorphisms)和6個候選基因。通過連鎖分析和關聯分析, Zhang等[10]共鑒定13個穗軸粗QTL和25個穗軸粗顯著關聯SNP。

目前, 有關玉米穗軸粗全基因組關聯分析和候選基因的研究報道較少。本研究利用309份材料構成的關聯群體對穗軸粗進行全基因組關聯分析, 挖掘玉米穗軸粗顯著關聯位點和候選基因, 為選育穗軸產量高的玉米新品種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和田間試驗設計

選用國內玉米核心種質和黃淮海骨干自交系等309份材料作為關聯群體。在2017年夏, 309份材料分別種植在河南新鄉原陽(Yuanyang, YY)、河南商丘虞城(Yucheng, YC)、河南周口鄲城(Dancheng, DC)和海南三亞(Sanya, SY)。2019年夏種植在原陽。采用隨機區組試驗設計, 2行區, 2粒播, 行距60 cm, 株距25 cm, 每行15株, 共設3個重復。脫粒后, 測量穗軸粗。

1.2 表型數據統計分析

利用R語言對不同環境穗軸粗進行相關性分析。利用QTL IciMapping v4.0[11]對2017年原陽、鄲城、虞城、三亞和2019年原陽進行聯合方差分析, 并計算廣義遺傳力和最佳線性無偏估計值(best linear unbiased estimator, BLUE)。

1.3 基因型鑒定和分析

309份自交系采用GBS (genotyping-by-sequencing)簡化測序的方法進行基因型鑒定。測序儀為Illumina HiSeq PE150雙端測序。利用BWA軟件比對B73參考基因組(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/ release-36/fasta/zea_mays/dna/Zea_mays. AGPv4.dna. toplevel.fa.gz)。采用SAMTOOLS軟件檢測群體SNP。以缺失率小于0.10, 雜合率小于0.10, 最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于0.05為篩選條件, 獲得58,129個SNP用于后續分析。

1.4 全基因組關聯分析

利用2017年原陽、鄲城、虞城、三亞、2019年原陽和BLUE環境的穗軸粗進行全基因組關聯分析。為了控制假陽性和假陰性, 本研究利用FarmCPU (fixed and random model circulating pro-bability unification)[12]、MLMM (multiple loci mixed linear model)[13]和CMLM (compressed mixed linear model)[14]方法的(群體結構) +(親緣關系)模型進行全基因組關聯分析。群體結構值由Structure v2.3.4計算。其中亞群數為1~8, length of burn-in period為5000, 蒙特卡羅重復個數為50,000, 每個亞群數迭代次數為3。根據Δ的結果, 確定亞群數為2時的值用于關聯分析。親緣關系值由TASSEL v5.0軟件的Centered_IBS方法計算。顯著臨界值設置為=0.05/58129=8.60E-07。FarmCPU和MLMM方法顯著位點的表型變異解釋率(phenotypic variation explained, PVE)采用線性回歸方法計算[15], CMLM方法的PVE由軟件給出[13]。利用ANNOVAR對顯著關聯位點挖掘穗軸粗的候選基因。通過檢索maizeGDB, 獲得候選基因在不同組織的轉錄表達數據。

2 結果與分析

2.1 穗軸粗表型數據分析

2017年和2019年不同環境關聯群體的軸粗變異范圍為1~4 cm。從柱狀圖的擬合曲線上看, 除了YY2019, 其余4個環境的穗軸粗基本符合正態分布(圖1)。多環境穗軸粗的廣義遺傳率為0.77。相關性分析表明不同環境間均存在顯著正相關關系(= 0.15~0.51,<0.05) (圖1)。而且, 2017年4個環境的穗軸粗相關系數較高。其中, 2017年鄲城和虞城穗軸粗的相關系數最高, 為0.51 (<0.001), SY2017和YY2017間的相關系數為0.50 (<0.001)。2019年原陽的穗軸粗與2017年4個環境的相關系數均較低(= 0.15~0.33)。

綜合5個環境的聯合方差分析表明, 關聯群體基因型間存在極顯著差異(表1), 說明材料間穗軸粗存在顯著的遺傳變異。不同環境間和基因型與環境互作也存在極顯著差異(表1)。這說明, 盡管穗軸粗的遺傳力較高, 也受到環境因素的影響。

表1 多環境聯合方差分析

圖中對角線方框為性狀的柱狀圖, 上三角為相關系數和顯著性程度。0.05、0.01、0.001 顯著水平分別標*、**、***。下三角為不同環境間穗軸粗的散點圖。SY、DC、YC和YY分別表示三亞、鄲城、虞城和原陽。2017和2019代表年份。

Histograms are showed in diagonal. Correlation values and significant levels represented by asterisk are showed in upper triangular matrix. Significant levels 0.05, 0.01, and 0.001 are denoted by *, **, and ***, respectively. Scatter plots of ear cob diameter are showed in lower triangular matrix. SY, DC, YC, and YY represent Sanya, Dancheng, Yucheng, and Yuanyang, respectively. 2017 and 2019 denote years.

2.2 穗軸粗全基因組關聯分析

利用58,129個SNP標記對2017年鄲城、虞城、原陽、三亞、2019年原陽和BLUE環境的穗軸粗進行全基因組關聯分析, 共檢測到12個穗軸粗顯著關聯SNP, 其中5個位于基因間, 4個位于內含子區和3個位于外顯子區(表2)。CMLM方法沒有檢測到穗軸粗顯著關聯位點(附圖1)。MLMM方法僅在2017年原陽檢測到1個顯著SNP, 即S4_29277313 (= 7.96E-07), 位于第4號染色體上的外顯子區, 解釋表型變異小于1%, 為控制穗軸粗的微效位點(圖2、表2和附圖2)。FarmCPU方法對不同環境(除了2019年原陽)穗軸粗均具有較好的擬合效果(圖2和附圖2)。該模型共檢測到12個顯著SNP (= 1.12E-09~6.12E-07) (圖2和表2)。其中, BLUE環境檢測到4個SNP, 2017年鄲城、三亞、虞城和原陽分別檢測到2個、2個、1個和3個顯著SNP。其中, FarmCPU模型也檢測到S4_29277313。FarmCPU模型共檢測到4個主效SNP。S1_29006330位于第1號染色體bin1.02, 解釋穗軸粗變異率為13.10%。在第2號染色體上, 檢測到2個主效SNP, 即S2_170889116和S2_204602646, 分別解釋穗軸粗變異率為14.17%和10.23%。S4_83821463位于第4號染色體bin4.05, 解釋穗軸粗變異率為12.83%。不同環境間沒有檢測到相同的SNP, 這也說明穗軸粗受環境的影響較大。

A和B: BLUE環境FarmCPU方法; C和D: 2017年鄲城FarmCPU方法; E和F: 2017年三亞FarmCPU方法; G和H: 2017年虞城FarmCPU方法; I和J: 2017年原陽FarmCPU方法; K和L: 2017年原陽MLMM方法。

A and B: FarmCPU in BLUE environment; C and D: FarmCPU in Dancheng in 2017; E and F: FarmCPU in Sanya in 2017; G and H: FarmCPU in Yucheng in 2017; I and J: FarmCPU in Yuanyang in 2017; K and L: MLMM in Yuanyang in 2017.

2.3 穗軸粗候選基因分析

從12個穗軸粗顯著關聯SNP中共挖掘17個候選基因(表2), 結合maizeGDB中基因的轉錄表達數據(附圖3), 發現(核仁素蛋白)和(HMGA)在穗發育相關的4個組織(16~19 d的分生組織、2~4 mm穗原基、6~8 mm穗原基和雌小穗)中表達量較高, 分別為63.9~157.1和61.5~107.5。編碼組蛋白-賴氨素N-甲基轉移酶ATX4 (Arabidopsis trithorax 4), 在16~19 d的分生組織、2~4 mm穗原基和6~8 mm穗原基的表達量較高, 達到97.0~119.2。編碼的產物是single myb histone 6 (SMH6), 在4個組織中的表達量為15.5~19.3。是ZIM (zinc-finger protein expressed in inflorescence meristem)轉錄因子ZIM35, 在16~19 d的分生組織中表達量較高(17)。編碼染色質組裝因子1亞單位FAS1 (chromatin assembly factor 1 subunit FAS1), 在2~4 mm穗原基的表達量最高(21.2)。Zm0000 1d029814編碼木葡聚糖內糖基轉移酶/脫水酶蛋白XTH32(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 32), 在雌小穗中表達量較高(48), 在16~19 d的分生組織表達量為17.9。候選基因編碼細胞壁連接的類受體激酶WAKL14 (wall-associated receptor kinase-like 14), 在4個組織中表達量較低(1.8~4.3)。(S-腺苷-L-甲硫氨酸依賴的甲基轉移酶超家族蛋白)、(有機陽離子/肉堿轉運體7)、(蘇氨酸合酶1)、和在4個組織中不表達或表達量較低。

3 討論

全基因組關聯分析是以連鎖不平衡為基礎來挖掘覆蓋全基因組遺傳變異的一種方法。目前, GWAS已發展了大量統計方法, 例如MLM、FarmCPU、CMLM、MLMM和Fast-LMM (factored spectrally transformed linear mixed models)等[16-17]。本研究利用FarmCPU、CMLM和MLMM方法對穗軸粗進行關聯分析, 發現FarmCPU的擬合效果最好, CMLM和MLMM方法擬合效果不理想(圖2、附圖1和附圖2)。Liu等[18]利用FarmCPU、MLM和CMLM方法對玉米籽粒性狀進行分析時, 也發現FarmCPU方法的檢測功效最高。

本研究共發現12個穗軸粗顯著關聯SNP (<8.6E-07)。其中, 9個SNP位于控制產量、穗部相關性狀(穗粒數、穗行數、行粒數、穗長、穗粗、軸重和軸粗)和籽粒相關性狀(粒長、粒寬、粒厚和百粒重)的QTL區間內。S1_29006330在Zhang等[10]鑒定的1個穗軸粗QTL (qCD1-1)區間內。S1_29006330解釋穗軸粗的變異率為13.10%, 為主效SNP。因此, S1_29006330可能是影響穗軸粗的重要位點, 可用于分子標記輔助育種。S4_83821463是控制穗軸粗的主效SNP (PVE=12.83%), 位于bin4.05, 該區域內檢測到1個控制穗長的QTL[1], 1個控制行粒數的QTL[1], 1個控制穗行數的QTL[10]和1個控制產量、穗部性狀和籽粒大小性狀的元QTL (MetaQTL-27)[15]。S2_170889116也是控制穗軸粗的主效SNP, 其PVE最高, 為14.17%, 位于bin2.06。該區域Choe等[1]檢測到1個同時控制單穗重和百粒重的QTL。主效SNP S2_204602646 (PVE=10.23%)在單穗粒重QTL qKWPE2-5區間內(201,971,890~209,300,839)[8]和控制穗部性狀和籽粒大小性狀的MetaQTL-13內[18]。主效SNP S4_83821463、S2_170889116和S2_204602646均在整合穗軸粗的元QTL內, 說明這3個主效SNP也可能是影響穗軸粗的重要位點。S3_170875493的表型變異解釋率較高, 為8.55%, 位于bin3.06區域內。Upadyayula等[5]在該區域內鑒定到1個控制行粒數QTL。此外, 微效位點S5_17720377位于bin5.03, 該區域內Choe等[1]檢測到1個同時控制穗軸重和百粒重的QTL。Yi等[8]在bin5.03區域內檢測1個穗行數QTL qRN5。S5_17720377還位于控制穗部相關性狀和籽粒性狀的MetaQTL-32[19]內。S2_170090146位于Chen等[19]通過元分析整合的MetaQTL-11區間內, 該區間影響產量、穗部和籽粒大小相關性狀。在S1_143964620和S4_29277313相關的bin區段內, Choe等[1]分別檢測到1個粒長QTL和1個穗粒數QTL。不管是主效位點還是微效位點, 穗軸粗顯著關聯位點主要與已定位的穗部性狀QTL區間存在重疊, 這說明穗軸粗可能是穗部多個性狀共同調控的產物。

12個穗軸粗顯著關聯位點共檢測到17個候選基因。編碼細胞壁連接類受體, 為主效SNP S1_29006330的候選基因。WAK是植物類受體激酶, 由胞外域、跨膜域和胞內域組成, 能夠跨越質膜, 使細胞識別并對外部環境進行響應[20]。轉錄本沉默會導致植株矮化、根發育受損和花粉敗育[21]。WAKL具有典型的WAK結構, 可能參與花粉發育等穗發育相關的過程。根據maizeGDB的轉錄表達數據, 盡管在16~19 d的分生組織和雌小穗表達量較低(3.8~4.3), 但高于其余20個組織(附圖3)。而且, 該基因對應的SNP S1_29006330在已定位的穗軸粗QTL區間內[10]。這表明,()可能是穗軸粗的候選基因。

編碼轉錄因子, 為主效SNP S4_83821463挖掘的候選基因。ZIM具有GATA類鋅指結構域即C-X2-C-X20-C-X2-C, 是一類植物特異的GATA轉錄因子[22]。Zhang等[10]利用連鎖分析和全基因組關聯分析挖掘的1個穗粗候選基因是轉錄因子。在16~19 d的分生組織和花絲中表達量較高(17.0~17.1) (附圖3)。因此,()可能是影響穗軸粗的重要基因。S4_83821463挖掘的另一個基因, 編碼高速泳動族蛋白-Y。其在16~19 d的分生組織、2~4 mm穗原基、6~8 mm穗原基和雌小穗中表達量較高(61.5~107.5) (附圖3)。與SQUAMOSA啟動子綁定蛋白類家族(SQUAMOSA promoter-binding protein-LIKE, SPL)結合形成異二聚體, 參與調節楸樹的花器官發育, 但并不參與調節花期[23]。玉米SBP轉錄因子unbranched 2 ()和是SQUAMOSA啟動子綁定蛋白家族成員, 通過調節側原基和花序發育, 影響穗行數和雄穗分支數[24-25]。因此,()也可能是影響穗軸粗的重要基因。

S2_170889116是解釋穗軸粗變異最高的1個主效SNP, 其挖掘的候選基因為(核孔復合蛋白)。該基因在16~19 d的分生組織、2~4 mm穗原基和6~8 mm穗原基的表達量較高(38.0~61.7)。核孔復合蛋白是核膜上的運輸通道, 在染色質組裝和基因表達中發揮重要作用[26]。但目前, 尚沒有該類蛋白參與穗發育相關過程的研究報道。主效SNP S2_204602646挖掘的候選基因(組蛋白-賴氨素N-甲基轉移酶)在16~19 d的分生組織、2~4 mm穗原基和6~8 mm穗原基的表達量均較高(97.0~119.2) (表2和附圖3)。突變體表現出矮化和結實率低[27]。而且, 從花發育的十二時期開始, 相比正常植株, 該突變體的雄蕊發育遲緩[27]。因此,()可能是影響穗軸粗的重要候選基因。

此外, Wang等[28]通過整合產量相關性狀全基因組關聯分析和元分析結果, 發現1個候選基因編碼木葡聚糖內糖基轉移酶。木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶是一類細胞壁松弛因子, 通過調節細胞壁彈性和延伸性來影響植物的生長發育和響應逆境脅迫等[29]。木葡聚糖內糖基轉移酶/水解酶蛋白在過表達植株中表達上調, 從而導致了下胚軸和葉柄的延伸[30]。因此,()與一樣可能是控制穗軸粗的重要基因。穗軸粗候選基因的挖掘為下一步精細定位和克隆提供信息, 為解析玉米穗軸粗遺傳機理提供研究基礎。

4 結論

發現12個與穗軸粗顯著關聯的SNP (<8.60E-07)。其中, 主效SNP 4個, 解釋穗軸粗的變異率為10.23%~14.17%。挖掘候選基因17個, 其中、轉錄因子、、組蛋白-賴氨素N-甲基轉移酶和可能是影響穗軸粗的重要基因。

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[29] Miedes E, Suslov D, Vandenbussche F, Kenobi K, Ivakov A, Van Der Straeten D, Lorences E P, Mellerowicz E J, Verbelen J P, Vissenberg K. Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolatedhypocotyls., 2013, 64: 2481–2497.

[30] Shikata M, Matsuda Y, Ando K, Nishii A, Takemura M, Yokota A, Kohchi T. Characterization ofZIM, a member of a novel plant-specific GATA factor gene family., 2004, 55: 631–639.

附圖1 CMLM方法不同環境穗軸粗(CD)全基因組關聯分析的曼哈頓圖和QQ圖

Fig. S1 Manhattan plots and quantile-quantile plots for genome-wide association analysis for ear cob diameter using CMLM method in different environments

DC、YC、SY、YY分別表示鄲城、虞城、三亞和原陽。2017和2019代表年份。

DC, YC, SY, and YY represent Dancheng, Yucheng, Sanya, and Yuanyang, respectively. 2017 and 2019 denote in 2017 and in 2019.

附圖2 MLMM和FarmCPU方法沒有檢測到顯著穗軸粗SNP的曼哈頓圖和QQ圖

Fig. S2 Manhattan plots and quantile-quantile plots for no significant SNP for ear cob diameter using MLMM and FarmCPU

DC、YC、SY、YY分別表示鄲城、虞城、三亞和原陽。2017和2019代表年份。

DC, YC, SY, and YY represent Dancheng, Yucheng, Sanya, and Yuanyang, respectively. 2017 and 2019 denote in 2017 and in 2019.

附圖3 maizeGDB中17個候選基因在不同組織的表達情況

Fig. S3 Expression profiles of 17 candidate genes in different tissues retrieved from maize GDB

Genome-wide association study of ear cob diameter in maize

MA Juan, CAO Yan-Yong, and LI Hui-Yong*

Institute of Cereal Crops, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China

Maize ear cob diameter is an important trait impacting the yield of grain and cob, and the analysis of its genetic mechanism will provide a guidance for high-yield breeding. In this study, the genotypes of 309 inbred lines were identified by genotyping-by-sequencing technology. FarmCPU (fixed and random model circulating probability unification), MLMM (multiple loci mixed linear model), and CMLM (compressed mixed linear model) were used to identify significant single nucleotide polymorphisms (SNP) for ear cob diameter of Yuanyang of Henan province, Dancheng of Henan province, Yucheng of Henan province, Sanya of Hainan province in 2017 and 2019, and best linear unbiased estimate environment. A total of 12 significant SNP for ear cob diameter were detected at< 8.60E-07. S4_29277313 was detected from Yuanyang in 2017 using FarmCPU and MLMM. The phenotypic variance explained of S1_29006330, S2_170889116, S2_2046026464, and S4_83821463 ranged from 10.23% to 14.17%, and were considered major-effect SNP. In addition, S1_29006330 was mapped in the interval of known QTL for ear cob diameter. A total of 17 candidate genes were identified. Among them,(wall-associated receptor kinase-like 14), transcription factor(zinc-finger protein expressed in inflorescence meristem 35),(HMG-Y-related protein A), histone-lysine N-methyltransferase(trithorax 4), and(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 32) might be important genes for ear cob diameter. The identification of four major-effect SNP and five candidate genes can provide an information for molecular marker-assisted breeding, fine mapping, and gene cloning.

maize; genome-wide association study (GWAS); FarmCPU; ear cob diameter

10.3724/SP.J.1006.2021.03048

本研究由河南省科技攻關項目(182102110368)和河南省農業科學院優秀青年基金(2020YQ04)資助。

This study was supported by the Science and Technology Project of Henan Province (182102110368) and the Science-Technology Foundation for Outstanding Young Scientists of Henan Academy of Agricultural Sciences (2020YQ04).

李會勇, E-mail: lihuiyong1977@126.com

E-mail: majuanjuan85@126.com

2020-08-14;

2020-12-01;

2021-01-04.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210104.1147.004.html