澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物功能成分與抗氧化活性及其相關性分析

郭剛軍，胡小靜，付鎵榕，馬尚玄，徐 榮，黃克昌，彭志東，賀熙勇，鄒建云,

（1.云南省熱帶作物科學研究所，云南 景洪 666100；2.文山學院化學與工程學院，云南 文山 663000）

自由基是人體新陳代謝酶促反應所產生具有未成對電子的原子、分子、離子和基團，其性質活潑且具有強烈的氧化作用[1]。過量的自由基對人體危害很大，它可以氧化各種酶和蛋白質的巰基，改變其功能和結構；破壞細胞膜上的多糖結構，影響細胞功能的發揮；損害核酸和染色體，使生物體發生突變或產生病變。攝入具有自由基清除能力的食物或藥物（即通常所說的抗氧化劑）可減緩自由基對機體的侵害，預防動脈粥樣硬化、糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤、機體衰老及各種炎癥等病變的發生[2-3]。許多研究證實植物源提取物和酚類、黃酮類、醌類、皂苷、多糖、生物堿等功能成分具有很好的抗氧化活性[4-6]。

澳洲堅果（Macadamia ternifoliaF.Muell）又名夏威夷果、昆士蘭果、昆士蘭栗、澳洲胡桃等，原產于澳大利亞的亞熱帶雨林[7]，因其果仁營養豐富、口感細膩、味美可口、營養價值高，被譽為“堅果之王”[8]。我國澳洲堅果自上世紀九十年代開始商業化種植，現主要分布在云南、廣西和貴州等?。▍^），2017年種植面積279.64萬 hm2，占全球總種植面積的61.86%[9]。澳洲堅果果實由青皮、果殼和果仁組成，其青皮占鮮果質量的45%～60%，產量巨大[10-11]。研究表明，澳洲堅果青皮中蘊含蛋白質、糖類、酚類、單寧、黃酮、酚酸、有機酸、皂苷、P、K、Ca、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn等多種營養與功能成分；其中，酚類中包含沒食子酸、對羥基苯甲醇、3,4-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛等化合物，皂苷中含有極具生物活性與藥理作用的豆腐果苷和熊果苷成分[12-14]。澳洲堅果青皮是采后處理加工環節的主要副產物，目前僅有極少量用作漚肥或飼料，絕大部分被丟棄，其本身所具有的保健、藥用和經濟價值尚未引起足夠的重視，其提取物中總酚、黃酮、多糖等抗氧化成分含量及活性的相關研究也尚不多見。為此，本研究以澳洲堅果青皮為實驗材料，通過提取與萃取獲得其不同極性部位的分步提取物，測定其總酚、黃酮與多糖等主要功能成分含量，評價其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、超氧陰離子、2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力與還原力，并分析它們之間的相關性，以期為開發利用澳洲堅果青皮資源提供一定的技術依據，有效促進澳洲堅果產業的健康、可持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲堅果青皮采自云南省熱帶作物科學研究所實驗基地。

沒食子酸（色譜純）、蘆?。ㄉV純）、葡萄糖（色譜純）標準品 合肥博美生物科技有限公司；DPPH 美國Sigma-Aldrich公司；ABTS 上海華藍化學科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SB-5200DT型超聲波清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司；BGZ-240型電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；RV10型旋轉蒸發儀 德國IKA集團；SGIA-100F型冷凍干燥機 寧波市雙嘉儀器有限公司；DZKW-4型電子恒溫水浴鍋 上?？莆鲈囼瀮x器廠；UV-754N型紫外-可見分光光度計 上海菁華科技有限公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物的制備

新鮮澳洲堅果青皮經挑揀、清洗，40 ℃烘干，粉碎，過60 目篩，用80%（體積分數，下同）乙醇在溫度60 ℃、料液比1∶8（m/V）條件下超聲提取2 h，重復3 次，合并提取液，過濾，減壓濃縮至無乙醇味。將80%乙醇提取物用適量蒸餾水充分混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，分別重復3 次，剩余提取液為水溶解物，減壓回收溶劑，冷凍干燥，得到澳洲堅果青皮80%乙醇提取物、石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物與水溶解物，備用[15]。

1.3.2 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物功能成分測定

1.3.2.1 總酚質量分數的測定

采用福林-酚法測定總酚質量分數：總酚標準曲線繪制參照文獻[16]，以沒食子酸標準品為標樣，采用最小二乘法作線性回歸，得到沒食子酸標準溶液質量濃度x/（μg/mL）與吸光度y標準曲線的回歸方程：y＝0.013 9x+0.001 8，決定系數R2＝0.999 5。然后分別取10 mg澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻。量取1.0 mL定容液，依次加入1.0 mL福林-酚溶液與5.0 mL蒸餾水，室溫放置3～4 min，再加入3.0 mL質量分數15%的Na2CO3溶液，40 ℃水浴60 min，在762 nm波長處測定其吸光度，對照標準曲線，換算得出澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物的總酚質量分數。

1.3.2.2 黃酮質量分數的測定

NaNO2-Al(NO3)3比色法測定黃酮質量分數：黃酮標準曲線繪制參照文獻[17]，以蘆丁標準品為標樣，采用最小二乘法作線性回歸，得蘆丁標準溶液質量濃度x/（mg/mL）與吸光度y標準曲線的回歸方程：y＝11.695x+0.01，決定系數R2＝0.999 5。然后分別取10 mg澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物，加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，搖勻。量取2.0 mL定容液，加入質量分數5% NaNO2溶液1.0 mL，室溫靜置5 min，加入質量分數10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min，再加入質量分數4% NaOH溶液10 mL，蒸餾水定容至25 mL，靜置30 min，顯色，在510 nm波長處測定其吸光度，對照標準曲線，換算得出澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物的黃酮質量分數。

1.3.2.3 多糖質量分數的測定

苯酚-硫酸法測定多糖質量分數：多糖標準曲線繪制參照文獻[18]，以葡萄糖標準品為標樣，采用最小二乘法進行線性回歸，得葡萄糖標準溶液質量濃度x/（μg/mL）與吸光度y標準曲線的回歸方程：y＝0.017 3x+0.008 5，決定系數R2＝0.999 2。然后分別取10 mg澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物，加蒸餾水溶解并定容至100 mL，搖勻。量取2.0 mL定容液，加入1.0 mL 5%苯酚溶液與5.0 mL濃硫酸，搖勻，70 ℃水浴15 min，在490 nm波長處測定其吸光度，對照標準曲線，換算得出澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物的多糖質量分數。

1.3.3 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除率測定

在10 mL試管中依次加入3.9 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液和0.1 mL不同質量濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL，下同）澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標準品樣液，混勻后，在517 nm波長處測定其吸光度，記為As；再對0.04 mg/mL DPPH溶液在517 nm波長處測定吸光度，記為Ao，按式（1）計算DPPH自由基清除率[19]。

1.3.3.2 超氧陰離子自由基清除率測定

鄰苯三酚自氧化速率的測定：取4.5 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2）、4.2 mL蒸餾水混勻，25 ℃水浴保溫20 min，取出后立即加入25 ℃預熱過的3.0 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻后，在325 nm波長處每隔30 s測定其吸光度，計算線性范圍每分鐘內吸光度的增加量，并以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。

加入不同質量濃度澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標準品樣液后鄰苯三酚自氧化速率的測定：按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入0.1 mL樣品液，蒸餾水相應減少0.1 mL。同樣以10 mmol/L HCl溶液配制空白管作為對照。按照式（2）計算超氧陰離子自由基清除率[15]。

式中：ΔA1/Δt為鄰苯三酚自氧化反應速率；ΔA2/Δt為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化反應速率。

1.3.3.3 ABTS陽離子自由基清除率測定

取440 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液加入到25 mL 7 mmol/L ABTS溶液中混合，避光反應12～16 h。使用前用80%乙醇溶液稀釋100 倍，使405 nm波長處吸光度為0.70±0.02，得到ABTS工作液。然后分別取0.15 mL不同質量濃度澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標準品樣液加入5.7 mL ABTS工作液，混勻，室溫放置10 min，在734 nm波長處測定吸光度。按照式（3）計算ABTS陽離子自由基清除率[20]。

式中：AControl為5.7 mL ABTS工作液與0.15 mL 80%乙醇混合后的吸光度；ASample為5.7mL ABTS工作液與0.15 mL樣品液混合后的吸光度。

1.3.3.4 還原力測定

分別取2.5 mL不同質量濃度澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標準品樣液置于10 mL試管中，分別加入2.5 mL磷酸緩沖液（pH 6.6）和1.0 mL質量分數1.0%鐵氰化鉀溶液，50 ℃反應20 min，冰浴。冷卻至室溫后，加入1.0 mL質量分數10%三氯乙酸溶液，2 500 r/min離心20 min。取上清液5.0 mL加入4.0 mL蒸餾水，混勻，再加入1.0 mL質量分數0.1% FeCl3溶液，室溫靜置10 min，在700 nm波長處測定其吸光度，還原力用樣品吸光度A表示[21]。

1.3.3.5 抗氧化能力評價指標的計算

以澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物樣品質量濃度為橫坐標，抗氧化能力為縱坐標，研究其相關性與變化趨勢，求得線性回歸方程，以50%清除率對應質量濃度為樣品自由基清除能力半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）（IC50越低，抗氧化能力越強），斜率為增加系數（增加系數越大，隨質量濃度增加，抗氧化能力增加越快），R2為決定系數，表示擬合性（R2越接近1，擬合效果越好）。

1.4 數據統計分析

數據采用SAS 9.2軟件處理，應用方差分析與鄧肯法進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異具有統計學意義；采用皮爾遜法進行相關性分析；運用REG過程進行多元線性回歸分析。實驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物功能成分分析結果

表1 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物功能成分及質量分數Table 1 Contents of bioactive components in successive solvent extracts from macadamia green husk

酚類、黃酮與多糖等功能成分是植物生長代謝中的次生產物，廣泛存在于其葉、種子、根、莖、皮內，是具有抗氧化活性的天然化合物[22]。由表1可知，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物中的總酚、黃酮、多糖與皂苷及其他成分質量分數差異明顯。其中，總酚質量分數最高的是乙酸乙酯提取物，為（40.36±0.48）%，與其他提取物均有顯著差異（P＜0.05）；其次是正丁醇提取物，質量分數為（22.40±0.25）%，質量分數最低的是石油醚提取物，為（12.62±0.49）%。黃酮質量分數最高的也是乙酸乙酯提取物，為（41.68±0.93）%，與其他提取物均有顯著差異（P＜0.05）；其次是石油醚提取物，質量分數為（24.80±0.86）%，質量分數最低的是正丁醇提取物與水溶解物，分別僅為（8.84±0.49）%與（7.55±0.96）%，兩者之間無顯著差異（P＞0.05）。多糖質量分數最高的是正丁醇提取物，為（22.08±2.09）%，與其他提取物均有顯著差異（P＜0.05）；其次是乙酸乙酯提取物，質量分數為（8.78±0.46）%，質量分數最低的是氯仿提取物，僅為（0.74±0.09）%。張明楷等[23]研究表明不同品種澳洲堅果青皮中含有5.04%～9.21%的蛋白質；施蕊等[24]研究表明澳洲堅果青皮乙醇提取物中含有豆腐果苷、熊果苷等皂苷類物質。由此推測，本研究制備的澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物還含有皂苷、蛋白質等其他成分，其質量分數最高的是水溶解物，為（67.27±1.48）%，與其他提取物均有顯著差異（P＜0.05）；其次是80%乙醇提取物，質量分數為（62.50±0.79）%，質量分數最低的是乙酸乙酯提取物，僅為（9.17±1.15）%。綜上可知，80%乙醇從澳洲堅果青皮中提取了大量的功能成分。其中，乙酸乙酯從其提取物中富集的總酚和黃酮質量分數最高，正丁醇富集的多糖質量分數最高，可見它們對澳洲堅果青皮中酚類、黃酮與多糖等成分的初步分離是有效的。

2.2 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物的抗氧化活性

2.2.1 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除作用

表2 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除能力Table 2 DPPH radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk at different concentrations

表3 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除效果指標Table 3 Linear regression equations of DPPH radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk versus concentration and IC50

DPPH自由基是一種人工合成的、穩定的有機自由基，具有制備方便、實驗重現性好等優點，其清除率被廣泛用于樣品抗氧化能力的評價[25-26]。由表2、3可知，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除率在不同質量濃度間存在顯著差異（P＜0.05），相同質量濃度不同提取物間也存在顯著差異（P＜0.05）。在質量濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內，不同提取物對DPPH自由基清除率與其質量濃度呈良好的線性正相關關系。其中乙酸乙酯提取物清除能力較強，相同質量濃度下僅次于蘆丁標準品，在質量濃度0.2 mg/mL時清除率為（22.50±0.53）%，與其他提取物與蘆丁標準品存在顯著差異（P＜0.05），隨著質量濃度的增加，乙酸乙酯提取物清除率增加最快，增加系數為58.085，當質量濃度達到1.0 mg/mL時，清除率為（70.09±0.73）%，與其他提取物、蘆丁標準品存在顯著差異（P＜0.05）；其次為正丁醇提取物，在質量濃度0.2 mg/mL時清除率為（17.86±0.71）%，隨質量濃度的增加，其清除率增加也較快，增加系數為45.100，當質量濃度達到1.0 mg/mL時，清除率為（54.03±0.50）%。對DPPH自由基清除能力最差的為80%乙醇提取物，在質量濃度0.2 mg/mL時清除率僅為（5.20±0.39）%，與相同質量濃度下的水溶解物無顯著差異（P＞0.05），且隨質量濃度的增加其清除率增加較慢，增加系數僅為10.105，當質量濃度達到1.0 mg/mL時，清除率僅為（13.08±0.62）%。從評價樣品對DPPH自由基清除能力的IC50來看，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標準品對DPPH自由基清除能力的大小順序為蘆丁標準品（IC500.29 mg/mL）＞乙酸乙酯提取物（IC500.67 mg/mL）＞正丁醇提取物（IC500.92 mg/mL）＞氯仿提取物（IC501.41 mg/mL）＞石油醚提取物（IC502.36 mg/mL）＞水溶解物（IC503.41 mg/mL）＞80%乙醇提取物（IC504.65 mg/mL）。

2.2.2 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對超氧陰離子自由基的清除作用

表4 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對超氧陰離子自由基的清除能力Table 4 Superoxide anion radical scavenging activity of successive solvent extracts from macadamia green husk at different concentrations

表5 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對超氧陰離子自由基的清除效果指標Table 5 Linear regression equations of superoxide anion radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk versus concentration and IC50

生物體內氧化還原反應中，大約有2%～5%的氧會產生超氧陰離子自由基，其是羥基等多種自由基的衍生源，超氧陰離子自由基的清除能力是評價樣品抗氧化能力的一個重要指標[27]。由表4、5可知，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標準品對超氧陰離子自由基清除率與其質量濃度呈較好的正相關關系。其中，正丁醇提取物清除能力最強，相同質量濃度下優于蘆丁標準品及其他提取物，且差異顯著（P＜0.05），在質量濃度0.2 mg/mL時清除率便達到（64.95±0.62）%，隨著質量濃度的增加，其清除率增加相對較快，增加系數為16.290，當質量濃度達到1.0 mg/mL時，清除率為（90.72±0.49）%；其次為氯仿提取物，在質量濃度0.2 mg/mL時清除率為（44.67±0.64）%，與蘆丁標準品及其他提取物存在顯著差異（P＜0.05），隨著質量濃度的增加，其清除率增加相對較慢，增加系數為9.800，當質量濃度達到1.0 mg/mL時，清除率僅為（52.92±0.67）%，與石油醚提取物無顯著差異（P＞0.05）。對超氧陰離子自由基清除能力較差的為80%乙醇提取物與水溶解物，在質量濃度1.0 mg/mL時清除率分別僅為（24.45±0.32）%與（33.84±0.68）%。從評價樣品對自由基清除能力的IC50來看，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標準品對超氧陰離子自由基清除能力的大小順序為正丁醇提取物（IC500.08 mg/mL）＞蘆丁標準品（IC500.18 mg/mL）＞氯仿提取物（IC500.72 mg/mL）＞石油醚提取物（IC500.89 mg/mL）＞乙酸乙酯提取物（IC501.02 mg/mL）＞水溶解物（IC501.16 mg/mL）＞80%乙醇提取物（IC502.57 mg/mL）。

2.2.3 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對ABTS陽離子自由基的清除作用

表6 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對ABTS陽離子自由基的清除能力Table 6 ABTS cation radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk at different concentrations

表7 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對ABTS陽離子自由基的清除效果指標Table 7 Linear regression equations of ABTS cation free radical scavenging capacity of successive solvent extracts from macadamia green husk versus concentration and IC50

ABTS陽離子自由基是通過過硫酸鉀氧化ABTS產生的一種自由基，其性質非常穩定，目前被廣泛應用于樣品抗氧化能力的測定[28-29]。由表6、7可知，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標準品對ABTS陽離子自由基均有較強的清除作用，且清除率與其質量濃度呈良好的正相關關系。其中，乙酸乙酯提取物的清除能力較強，在質量濃度0.2 mg/mL時，其清除率為（67.08±2.41）%，僅次于蘆丁標準品，與其他提取物存在顯著差異（P＜0.05），隨著質量濃度的增加，其清除率增加相對較快，當質量濃度為0.4 mg/mL時便達到（96.99±0.18）%，與其質量濃度在0.6、0.8、1.0 mg/mL時的清除率無顯著差異（P＞0.05），優于相同質量濃度的蘆丁標準品及其他提取物。正丁醇提取物的清除率也較高，在質量濃度0.6 mg/mL時便達到了（97.07±0.18）%，與其質量濃度在0.8 mg/mL及1.0 mg/mL時的清除率無顯著差異（P＞0.05），也與相同質量濃度的乙酸乙酯提取物無顯著差異（P＞0.05），優于蘆丁標準品與其他提取物。80%乙醇提取物對ABTS陽離子自由基的清除能力相對較差，在質量濃度0.2 mg/mL時的清除率僅為（27.30±2.38）%，但隨著質量濃度的增加，其清除率增加較快，增加系數最大，為77.635，當質量濃度增加到1.0 mg/mL時，清除率達到了（89.14±0.33）%。從評價樣品對自由基清除能力的IC50來看，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標準品對ABTS陽離子自由基清除能力的大小順序為乙酸乙酯提取物（IC500.05 mg/mL）＞蘆丁標準品（IC500.07 mg/mL）＞正丁醇提取物（IC500.12 mg/mL）＞氯仿提取物（IC500.18 mg/mL）＞石油醚提取物（IC500.35 mg/mL）＞水溶解物（IC500.36 mg/mL）＞80%乙醇提取物（IC500.48 mg/mL）。

2.2.4 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物還原力分析結果

表8 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物的還原力Table 8 Reducing power of successive solvent extracts from macadamia green husk at different concentrations

還原力是評價生物樣品抗氧化活性的一個重要指標，吸光度越大還原力越大[30]。由表8、9可知，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標準品具有較強的還原力，且還原力與其質量濃度呈良好的正相關關系。其中，乙酸乙酯提取物的還原力最強，在質量濃度0.2 mg/mL時便達到0.994±0.013，當質量濃度增加到1.0 mg/mL時，還原力達到2.362±0.040，均與蘆丁標準品及其他提取物存在顯著差異（P＜0.05）；其次為正丁醇提取物，相同質量濃度下的還原力僅次于乙酸乙酯提取物，在質量濃度0.2 mg/mL時的還原力為0.694±0.010，當質量濃度增加到1.0 mg/mL時，還原力達到1.919±0.032。隨著質量濃度的增加，氯仿提取物的還原力增加較快，增加系數最大，為1.343 0，在質量濃度0.2 mg/mL時還原力為0.439±0.005，當質量濃度增加到1.0 mg/mL時，其還原力達到1.522±0.036。80%乙醇提取物的還原力相對較低，相同質量濃度下還原力低于其他提取物，但在0.6～1.0 mg/mL質量濃度范圍內的還原力仍高于蘆丁標準品。從評價樣品還原力的IC50來看，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物及蘆丁標準品還原力的大小順序為乙酸乙酯提取物（IC500.09 mg/mL）＞正丁醇提取物（IC500.16 mg/mL）＞氯仿提取物（IC500.19 mg/mL）＞水溶解物（IC500.27 mg/mL）＞石油醚提取物（IC500.36 mg/mL）＞80%乙醇提取物（IC500.53 mg/mL）＞蘆丁標準品（IC500.68 mg/mL）。

2.3 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性及功能成分質量分數相關性分析結果

2.3.1 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物各項指標相關性分析結果

表10 澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物各項指標的皮爾遜相關系數及其相關性檢驗結果Table 10 Pearson coefficients between antioxidant properties and bioactive components and correlation test of successive solvent extracts from macadamia green husk

由表10可知，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性與功能成分質量分數間存在良好的相關性，其對DPPH自由基的清除率與總酚、黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數分別為0.803 5、0.775 7與0.544 4；對超氧陰離子自由基的清除率與多糖質量分數呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數為0.615 9；對ABTS陽離子自由基的清除率與總酚、黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數分別為0.742 2、0.565 7與0.514 2；還原力與總酚、黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數分別為0.846 5、0.755 3與0.533 1。其抗氧化指標間存在極好的相關性，其還原力與DPPH自由基、超氧陰離子自由基、ABTS陽離子自由基清除率呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數分別為0.923 6、0.563 6與0.850 4；對ABTS陽離子自由基的清除率與DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除率呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數分別為0.721 9與0.587 4；對超氧陰離子自由基清除率與DPPH自由基清除率呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數為0.674 8。其功能成分間也存在良好的相關性，總酚質量分數與黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關（P＜0.01），相關系數分別為0.790 5與0.496 6。上述分析結果表明，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性與其所含有的功能成分種類及質量分數密切相關，但其功能成分對抗氧化活性的貢獻是復合作用的結果，需進一步進行多元回歸分析。

2.3.2 澳洲堅果不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性與功能成分多元回歸分析結果

植物及其不同部位提取物的強抗氧化能力并非單一功能成分的貢獻，而是多種成分共同作用的結果。不同功能成分聯用時可能會出現不同的結果，當復合成分效果大于單獨成分效果時為協同作用，等于時為加和作用，而小于時則為拮抗作用[31]。為找出澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物不同功能成分質量分數對其抗氧化活性的作用，分別以DPPH自由基清除率（Y1）、超氧陰離子自由基清除率（Y2）、ABTS陽離子自由基清除率（Y3）與還原力（Y4）為因變量，總酚（X1）、黃酮（X2）、多糖（X3）與皂苷及其他成分（X4）質量分數為自變量進行逐步回歸分析，建立多元線性回歸方程（分別為I、II、III、IV），結果見表11。

表11 澳洲堅果不同極性溶劑分步提取物抗氧化活性與功能成分多元回歸分析結果Table 11 Results of multiple regression analysis between antioxidant activities and functional components of successive solvent extracts from macadamia green husk

由表11可知，澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對DPPH自由基的清除率與其總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質量分數之間的線性關系經逐步回歸分析后，4 個成分變量因對DPPH自由基清除率的回歸均達到極顯著水平（P＜0.01）而被引入方程。同時總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質量分數變量的標準回歸系數分別為-0.371 6、1.049 0、0.726 0與-0.160 8，表明其對DPPH自由基清除率作用的大小順序依次為黃酮＞多糖＞總酚＞皂苷及其他成分。經方差分析，該模型的F值為93.51，P＜0.000 1，決定系數R2為0.968 2，說明其有統計學意義，效果理想。得到的回歸方程為Y1＝7.634 4-0.071 0X1+0.170 2X2+0.227 6X3-0.013 3X4，它可以把提取物的清除DPPH自由基活性與功能成分之間的關系量化，表明在共同作用時，其與黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關，與總酚、皂苷及其他成分質量分數呈極顯著負相關。

澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對超氧陰離子自由基的清除率與總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質量分數之間的線性關系經逐步回歸分析后，皂苷及其他成分質量分數變量被剔除，總酚、黃酮、多糖質量分數變量因對超氧陰離子自由基清除率的回歸達到極顯著水平（P＜0.01）而被引入回歸方程。同時總酚、黃酮與多糖質量分數變量的標準回歸系數分別為-1.471 8、1.369 0與1.321 7，表明其對超氧陰離子自由基清除率作用的大小順序依次為總酚＞黃酮＞多糖。經方差分析，該模型的F值為24.15，P＜0.000 1，決定系數R2為0.857 8，說明其有統計學意義，效果理想。得到的回歸方程為Y2＝29.024 5-0.405 0X1+0.320 0X2+0.597 2X3，它可以把提取物清除超氧陰離子自由基活性與總酚、黃酮與多糖質量分數之間的關系量化，表明在共同作用時，其與黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關，與總酚質量分數呈極顯著負相關，與皂苷及其他成分質量分數相關性不顯著。

澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物對ABTS陽離子自由基的清除率與總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質量分數之間的線性關系經逐步回歸分析后，黃酮、多糖質量分數變量均被剔除，總酚質量分數變量因對清除率的回歸達到極顯著水平（P＜0.01），皂苷及其他成分質量分數變量因對清除率的回歸達到顯著水平（P＜0.05）而被引入回歸方程?？偡?、皂苷及其他成分質量分數變量的標準回歸系數分別為0.717 8與0.267 4，表明其對ABTS陽離子自由基清除率作用的大小順序為總酚＞皂苷及其他成分。經方差分析，該模型的F值為22.20，P＜0.000 1，決定系數R2為0.788 5，說明其具有統計學意義，效果理想。得到的回歸方程為Y3＝40.305 6+0.188 8X1+0.030 4X4，它可以把提取物清除ABTS陽離子自由基活性與總酚、皂苷及其他成分質量分數之間的關系量化，表明在共同作用時，其與總酚質量分數呈極顯著正相關，與皂苷及其他成分質量分數呈顯著正相關，與黃酮、多糖質量分數相關性不顯著。

澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物的還原力與總酚、黃酮、多糖、皂苷及其他成分質量分數之間的線性關系經逐步回歸分析后，總酚、皂苷及其他成分質量分數變量均被剔除，黃酮、多糖質量分數變量因對還原力的回歸達到極顯著水平（P＜0.01）而被引入回歸方程。黃酮、多糖質量分數變量的標準回歸系數分別為0.745 8與0.519 5，表明其對還原力作用的大小順序為黃酮＞多糖。經方差分析，該模型的F值為71.00，P＜0.000 1，決定系數R2為0.916 6，說明其具有統計學意義，效果理想。得到的回歸方程為：Y4＝0.298 2+0.004 5X2+0.006 0X3，它可以把提取物還原力與黃酮、多糖質量分數之間的關系量化，表明在共同作用時，其與黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關，與總酚、皂苷及其他成分質量分數相關性不顯著。

3 結 論

澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物中，乙酸乙酯提取物總酚與黃酮質量分數最高，正丁醇提取物多糖質量分數最高。澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物與蘆丁標準品具有較強的清除ABTS陽離子自由基能力與較高的還原力，對DPPH自由基與超氧陰離子自由基有一定的清除作用。其中，乙酸乙酯提取物對DPPH自由基清除能力優于其他5 種提取物，但低于蘆丁標準品，對ABTS陽離子自由基的清除能力與還原力優于蘆丁標準品及其他提取物；正丁醇提取物對超氧陰離子自由基的清除能力優于蘆丁標準品及其他提取物。澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物的抗氧化活性與其所含有的功能成分密切相關，是其共同作用的結果，對DPPH自由基的清除率與其黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關，與總酚、皂苷及其他成分質量分數呈極顯著負相關；對超氧陰離子自由基的清除率與其黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關，與總酚質量分數呈極顯著負相關，與皂苷及其他成分質量分數相關性不顯著；對ABTS陽離子自由基的清除率與其總酚質量分數呈極顯著正相關，與皂苷及其他成分質量分數呈顯著正相關，與黃酮、多糖質量分數相關性不顯著；還原力與黃酮、多糖質量分數呈極顯著正相關，與總酚、皂苷及其他成分質量分數相關性不顯著。實驗結果表明澳洲堅果青皮不同極性溶劑分步提取物尤其是乙酸乙酯提取物與正丁醇提取物具有較好的抗氧化活性，下一步可對其進行系統的分離與分析，確定具體的抗氧化物質，為澳洲堅果青皮的深度開發提供一定的理論依據。