基于靜電噴霧法蘿卜硫素微膠囊的制備與表征

王 梟，孟官麗，王齊蕾，汪浪紅，范代娣，呂新剛,

（1.西北大學食品科學與工程學院，陜西 西安 710069；2.西北大學化工學院，陜西省可降解生物醫用材料重點實驗室，陜西 西安 710069）

蘿卜硫素（sulforaphane，SF）是迄今為止從蔬菜中發現的抗癌活性最強的物質之一[1]，同時具有較強的抗氧化、抗炎、抑菌等活性，廣泛存在于西蘭花等十字花科植物中，但其性質不穩定，易受氧、熱、堿等條件的影響而降解，使其在食品、醫藥等行業中的應用受到限制。微膠囊化技術是保護目標成分的一種工具，可將有效成分截留在微納米級基質中，提高其穩定性。蛋白或多糖等具有高度生物相容性和生物降解性的大分子聚合物常被用作包封基質。

目前反溶劑沉降、冷凍干燥、噴霧干燥、納米沉淀、脂質體等技術已被用于制備SF微納米載體，Wu Huahua等[2]利用共沉淀法將SF與羥丙基-β-環糊精包合，提高了SF對環境因子的抗性，但制備過程較為復雜。Ko等[3]利用冷凍干燥技術制備了SF-PLGA微球，用于治療骨關節炎，但微球生產過程中涉及有機溶劑二甲基亞砜和二氯甲烷，應用于開發功能性食品或醫藥時，安全性受其殘留率影響，而且耗時、成本高。Wu Yuanfeng等[4]通過噴霧干燥技術制備SF微膠囊，但包封率僅為12.6%～39.8%，較低的包封率主要是由于噴霧干燥器進風溫度高（190 ℃）導致SF分解。靜電噴霧是一種新型高效的非熱加工包封技術，工藝簡單、靈活、經濟，對封裝熱敏活性物質十分有利[5]，在疏水性（姜黃素、白藜蘆醇、α-亞麻酸等）或親水性（表沒食子兒茶素沒食子酸酯、花青素等）生物活性物質的包封中已多有報道[6]，但其用于包封SF鮮見報道。

本研究以玉米醇溶蛋白（Zein）、殼聚糖（chitosan，CS）和明膠（gelatin，Gel）為載體，采用單軸和同軸靜電噴霧技術制備負載SF的納米粒子，應用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）和熱重分析表征微膠囊表面形貌、分子間相互作用和熱行為，并研究了微膠囊在模擬胃腸環境和食品基質中的釋放特性以及在高溫下的貯存穩定性，以闡明應用不同壁材通過靜電噴霧方法包封SF的可行性。該研究有助于進一步構建適用于SF的遞送載體，進而促進其產業化應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘿卜硫素 Sigma試劑（上海）有限公司；玉米醇溶蛋白 合肥博美生物科技有限公司；明膠 鄭州萬搏化工產品有限公司；殼聚糖 上海藍季生物科技發展有限公司；無水乙醇、冰乙酸、甲醇 西安中佳科技有限公司。

1.2 儀器與設備

JDF05靜電紡絲機 長沙納儀儀器科技有限公司；UltiMate 3000型高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；Gemini 300 SEM 德國卡爾蔡司股份公司；IRAffinity-1S FTIR儀 日本島津公司；STA 449F3熱重分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司；HL-25A臺式電熱恒溫干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 靜電噴霧溶液配制

SF微膠囊靜電噴霧溶液配制見表1，包封前溶液均需磁力攪拌均勻。

表1 聚合物溶液配制Table 1 Preparation of polymer solutions

1.3.2 SF微膠囊制備

靜電噴霧系統由高壓電源（0～30 kV）、注射泵和不銹鋼板收集器組成。將聚合物溶液導入5 mL注射器中，置于注射泵的凹槽上，通過聚四氟乙烯導管與定制的不銹鋼針頭（22/17G）連接。針頭固定在高壓電源的正極上，與接地的收集器垂直放置。具體工藝參考文獻[7]并根據本課題組前期預實驗稍作改動，系統運行參數見表2。

表2 制備SF微膠囊的系統運行參數Table 2 Operating parameters for preparing SF microcapsules

1.3.3 SF質量測定

根據吳元鋒[8]的研究并結合實際情況確定測定SF質量的高效液相色譜方法。采用UltiMate 3000型高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測器）；色譜柱為Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長195 nm；流動相為體積分數28%甲醇溶液（超純水配制）；等度洗脫，洗脫時間20 min；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。將不同質量濃度的SF標準溶液過0.22 μm濾膜后進樣，以質量濃度和峰面積分別為橫、縱坐標作標準曲線，標準曲線方程為y＝515.34x-0.438 6（R2＝0.999 9），SF峰值在15 min時出現，將樣品在15 min時對應的峰面積代入標準曲線，通過換算計算SF質量，單位為mg。

1.3.4 包封率及負載量的測定

單軸微膠囊分別用各自溶劑溶解壁材，同軸微膠囊先用一定體積的體積分數50%乙酸溶解外層壁材，再用等體積的體積分數80%乙醇溶解內層Zein，然后使用高效液相色譜測定SF質量，根據式（1）、（2）分別計算包封率和負載量。

1.3.5 SEM觀察

使用Gemini 300 SEM表征微膠囊形貌特征。加速電壓5 kV、工作距離6.5～7.5 mm，觀察前將樣品黏附于導電膠上并在真空下用金濺射鍍膜。使用Nano Measurer軟件對每個測試樣品的尺寸進行統計分析，以獲得粒徑的大小和分布區間。

1.3.6 FTIR分析

使用IRAffinity-1S FTIR儀分析微膠囊中的官能團和可能的化學相互作用。掃描范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為0.4 cm-1。

1.3.7 熱重分析

采用STA 449F3熱重分析儀，記錄微膠囊質量和質量損失速率隨溫度變化的情況。從30 ℃加熱到900 ℃，升溫速率為10 ℃/min，動態氮氣氣氛，流速為100 mL/min。

1.3.8 體外釋放行為考察

參考趙彬然[9]和Bhushani[10]等的方法并略加修改，考察模擬胃腸道消化對SF釋放的影響。稱取1.00 mg SF微膠囊，加入5 mL模擬胃液（pH 1.2），將混合物在37 ℃水浴振蕩培養2 h，胃消化結束后，再加入5 mL模擬腸液（pH 7），37 ℃振蕩反應4 h。消化期間每隔30 min取出0.5 mL并補充等量消化液。

根據歐盟法規EU 10/2011中規定，選用體積分數10%乙醇溶液和體積分數3%乙酸溶液分別模擬水性和酸性食品基質，考察SF在模擬食品基質中的釋放情況。稱取1.00 mg SF微膠囊，加入20 mL模擬基質溶液，50 r/min室溫磁力攪拌，定時取樣0.5 mL，并補充等量模擬基質溶液。采集的樣品經乙酸乙酯萃取、真空旋轉蒸發器濃縮、甲醇定容、0.22 μm濾膜過濾后，通過高效液相色譜法測定SF質量，根據式（3）計算SF累積釋放率，并繪制釋放曲線。

式中：Qti為ti時刻累積釋放率/%；ρti和ρti-1分別ti和ti-1時刻待測液中SF質量濃度/（mg/mL）；V0為釋放介質體積/mL；V1為每次取樣的體積（0.5 mL）；m為樣品中實際SF質量/mg。

1.3.9 熱穩定性分析

參考Wu Huahua[2]和Wu Yuanfeng[11]等的方法并稍作修改，考察SF微膠囊的熱穩定性。將SF微膠囊和等效的游離SF分裝于離心管中，置于（60±2）℃恒溫干燥箱中，每隔3 h取出一管，測定SF質量。以保留率來評價各壁材對SF穩定性的影響。

1.4 數據統計與分析

每組實驗平行3 次，采用SPSS 24軟件對數據進行統計，結果用平均值±標準差來表示，采用Origin Pro 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SF微膠囊的包封率和負載量

SF微膠囊的包封率和負載量見表3，Zein和Gel單軸微膠囊的包封率均高于95%，Zein/Gel和Zein/CS同軸微膠囊的包封率分別為（83.12±0.17）%和（68.01±7.50）%，這可能與SF和膠囊的質量比即理論負載量有關，負載量不同意味著芯材和壁材的分布不同，從而影響了微膠囊結構，使得SF的包封率產生了差異[12]。CS單軸微膠囊的包封率最低，僅為（10.77±1.19）%，可能是由于CS與SF之間發生化學相互作用，使SF未能從CS中完全脫離?？傊?，SF與壁材之間的質量比[13]、微膠囊的外觀形態以及芯材與壁材聚合物之間的相互作用[14]都可能會影響包封率和負載量。另外，微膠囊中SF的提取和測定方法以及芯材在所選壁材溶液中的溶解度也會對微膠囊的包封率和負載量產生影響。

表3 SF微膠囊的粒徑、包封率和負載量Table 3 Particle size, encapsulation efficiency and loading capacity of SF microcapsules

2.2 SF微膠囊的SEM分析結果

微膠囊的SEM圖與粒徑分布圖見圖1。3 種單軸微膠囊球形狀良好、表面光滑，與Zein、Gel和CS良好的成膜能力有極大的關系[15]，其中Gel-SF粒子一側呈凹陷結構，可能與Gel溶液性質和噴霧條件有關。兩種同軸納米粒子的表面形貌區別于單一壁材制備的納米粒子，其表面粗糙，呈現較多褶皺，可能是由于核殼結構內外溶劑揮發性的不同導致外部Gel或CS輕微凹陷，另外核殼壁材之間的相互作用也有一定的影響。

微膠囊平均粒徑范圍為427.80～1 857.04 nm（表3），粒徑與電壓、溶液濃度、流速等有關，一般隨電壓增大而減小，隨濃度和流速增大而增大[16]，也受復合因素的影響。從粒徑分布圖（圖1F）中可以看出，Zein-SF、CS-SF和Zein/CS-SF微膠囊粒徑分布較為集中，Gel-SF和Zein/Gel-SF分布較為分散?？傊?，靜電噴霧技術可獲得致密球形納米粒子，所得結構的形態和粒徑在很大程度上受溶液性質、工藝參數的影響，改變材料、濃度和噴霧電壓、流速等可調整微膠囊形狀。

圖1 SF微膠囊的SEM圖和粒徑分布圖Fig.1 Scanning electron micrographs and particle size distribution of SF microcapsules

2.3 SF微膠囊的FTIR分析結果

FTIR譜圖可用于表征復合物的分子間相互作用。如圖2所示，SF顯示4 個特征峰，2 187～2 113 cm-1（—N＝C＝S伸縮振動吸收峰）、1 453 cm-1（C—H變形振動吸收峰）、1 350 cm-1（C—H變形振動吸收峰）和1 251 cm-1（C—N伸縮振動吸收峰）。

Zein和Gel的FTIR譜形基本相似，3 299 cm-1/3 279 cm-1（酰胺A帶）和3 064 cm-1（酰胺B帶）處的峰與N—H拉伸有關，2 958 cm-1（C—H伸縮振動）、1 645 cm-1/1 635 cm-1（酰胺I帶）處的峰與C＝O伸縮振動有關，1 536 cm-1（酰胺II帶）和1 240 cm-1（酰胺III帶）處的峰分別與N—H和C—N偶合有關[17]。Gel特征峰在1 332 cm-1（脯氨酸CH2振動）和1 082 cm-1（C—O—C伸縮振動）處。同軸Zein/Gel有Gel的特征峰（1 326 cm-1和1 082 cm-1）證明核殼結構的形成，這與Torkamani等[18]報道的結果一致，酰胺A帶（3 294 cm-1）和酰胺I帶（1 639 cm-1）的特征峰介于Zein和Gel位移波數之間，可能是由于Gel和Zein之間的氫鍵相互作用[19]，酰胺B帶（3 067 cm-1）和酰胺III帶（1 246 cm-1）的特征峰均向高波數輕微轉移，可能是靜電相互作用的影響[20]。

圖2 游離和微膠囊形式SF的FTIR圖Fig.2 Fourier transform infrared spectra of SF in free and encapsulated forms

CS的FTIR譜圖中3 250、2 878 cm-1歸屬于糖環內及糖環上C—H的伸縮振動，1 547、1 408 cm-1處的強吸收峰分別歸屬于酰胺I帶和酰胺II帶；1 065 cm-1處的強吸收峰對應于糖環上C—O鍵的伸縮振動。同軸Zein/CS有CS的特征峰（1 408 cm-1），表明形成了核殼結構，同時氫鍵帶有輕微偏移，說明Zein和CS之間有氫鍵形成，另外在1 340～1 140 cm-1附近的譜圖區別于Zein和CS，可能是由于CS中帶正電荷的氨基與Zein中帶負電荷的氨基酸殘基間的靜電相互作用[21]。SF微膠囊與對應壁材微膠囊的譜圖基本一致，沒有新的特征峰出現，表明壁材與SF間無新化學鍵形成，壁材僅用作SF載體而不改變其性質，屬于物理包封[22]。另外Zein-SF、Gel-SF、Zein/Gel-SF在2 187～2 113 cm-1附近出現了SF特征峰（—N＝C＝S的伸縮振動），說明SF被成功包封，而CS-SF、Zein/CS-SF未發現SF特征峰，可能是由于SF負載量較低，被壁材的強特征峰所掩蓋。

2.4 SF微膠囊的熱重分析結果

微分熱重圖反映微膠囊降解速率與溫度的關系，分別在100 ℃和300 ℃附近出現兩個峰，在這兩處微膠囊降解速率達到最大。100 ℃附近降解速率最大，可能是微膠囊殘留的乙醇、乙酸以及吸附的水分蒸發所致，300 ℃附近降解速率最大可能是結合水、小分子化合物以及生物材料自身骨架分解的結果[22]。其中各壁材微膠囊最大降解速率對應的溫度：CS＜Zein/CS＜Zein＜Zein-Gel＜Gel，SF微膠囊最大降解速率對應的溫度：CS-SF＜Zein/CS-SF＜Zein-SF＜Zein/Gel-SF＜Gel-SF；可以發現同軸的微膠囊最大降解速率對應的溫度介于對應的兩壁材之間，SF微膠囊與對應壁材微膠囊的熱重和微分熱重曲線相似，最大降解速率所對應的溫度一致。降解溫度越高表明微膠囊越穩定，通過熱重分析可知，微膠囊在300 ℃的高溫下才大量降解，具有較高的熱穩定性，另外相比CS，Zein和Gel作微膠囊載體熱穩定性更好。

圖3 SF微膠囊的熱重分析和微分熱重曲線Fig.3 Thermogravimetric analysis and differential thermogravimetric analysis curves of SF microcapsules

對于游離SF而言，袁海娜[23]在進行熱重分析時發現，在檢測溫度范圍內（20～230 ℃）無法獲得SF的熱重分析曲線。劉艷鳳[24]在熱重分析表征SF微膠囊時未檢測游離SF含量。van Eylen等[25]通過在不同溫度下加熱樣品20 min來考察SF的熱穩定性，發現在90 ℃下處理20 min后SF降解率超過90%。吳元鋒[8]在其研究中發現，SF在90 ℃不同pH值下加熱6 h后，其殘留量很少，有的甚至檢測不到。這些結果可歸因于SF的揮發性和對溫度的敏感性，同時也證明了微膠囊對SF的保護作用，通過微膠囊化提高了SF的耐熱性。

2.5 SF微膠囊在模擬胃腸液中的釋放情況

SF微膠囊在模擬胃腸道消化下的動力學釋放曲線如圖4所示。SF在前期胃消化階段釋放速率快，Zein-SF、Gel-SF及Zein/Gel-SF前2 h累積釋放率均高于80%，Zein/CS-SF高于60%，CS-SF最低，不足20%；在后期腸消化階段均處于相對穩定狀態，Zein-SF、Gel-SF及Zein/Gel-SF累積釋放率較高（＞80%），釋放周期長，有良好的胃腸溶解性，Zein/CS-SF（＜70%）和CS-SF（＜20%）累積釋放率較低，這與趙彬然[9]、蘇軍慶[26]的研究結果趨勢一致。

圖4 SF微膠囊在模擬胃腸道條件下的釋放情況Fig.4 Release of SF microcapsules under simulated gastrointestinal conditions

SF微膠囊在胃環境中快速釋放SF，可能是由于SF微膠囊與釋放介質存在一定濃度梯度，以及微膠囊的高比表面積、高孔隙率，使分散在載體表面的SF釋放，同時由于胃液中胃蛋白酶侵蝕壁材，使微膠囊逐漸崩解，適度快速釋放可以使SF濃度迅速升高到有效治療濃度[21]；SF微膠囊后期在腸液中較穩定，腸是大多數口服制劑的主要吸收部位，多數活性物質需先從制劑中釋放出來，以分子形式溶解在消化液中才能進行跨膜吸收[26]，Zein-SF、Gel-SF及Zein/Gel-SF在腸液中一直保持較高的SF累積釋放率，利于人體吸收，從而提高其生物利用度，發揮SF功效。然而Zein/CS-SF和CS-SF的SF釋放率較低，可見微膠囊因其壁材成分的不同，其芯材在胃腸道環境中的釋放和消化效果有著較大的不同，這與馬鐵錚等[27]的研究結論一致。

2.6 SF微膠囊在模擬食品基質中的SF釋放情況

SF微膠囊在兩種模擬食品基質中的SF釋放曲線如圖5所示。SF在模擬水性基質中的釋放以Zein-SF和Gel-SF最迅速，在1 h累積釋放率即達到約80%；在模擬酸性基質中，Zein-SF、Gel-SF、Zein/Gel-SF中SF的累積釋放率在1 h達到74.5%～82.3%。鑒于以上形式的SF在模擬食品基質中的快速釋放，故進一步研究了其在0～1 h SF的釋放情況（圖5）?？傮w上1 h內SF累積釋放率線性增大，0～20 min，SF釋放相對緩慢，而20～60 min的釋放速率（曲線斜率）快速增加，其中Zein-SF的累積釋放率始終保持最高。在最初的1 h內SF的快速釋放通常與微膠囊表面或附近的生物活性分子的存在有關，當基質與釋放介質接觸后溶脹時，該分子會迅速釋放[28]，然后SF通過生物聚合物網絡的網孔擴散，持續釋放，呈現相對穩定趨勢，這與Atay等[28]的研究結果一致。然而，SF的釋放受食品模擬物的性質和殼基質的影響，在樣品之間可以觀察到細微差異。兩種釋放介質中Gel-SF最終SF累積釋放率均在80%左右，CS-SF和Zein/CS-SF的最終SF累積釋放率均低于20%，Zein-SF在體積分數3%乙酸溶液中的最終SF累積釋放率略低于體積分數10%乙醇溶液，而Zein/Gel-SF與之相反，在酸性介質中釋放較多，這可以歸因于在酸性條件下Gel的溶解度更高，聚合物基質快速膨脹[29]。本研究所用的壁材均為食品級，具有良好的生物可降解性，Zein-SF和Gel-SF微膠囊可添加到水性或酸性食品基質中，Zein/Gel-SF微膠囊可添加到酸性食品基質中，有利于進一步開發SF新型功能食品。

圖5 SF微膠囊在模擬食品基質中的釋放Fig.5 Release of SF microcapsules in simulated food matrices

2.7 SF微膠囊的熱穩定性分析結果

大多數生物活性化合物對熱敏感，貯存和進一步加工受其熱穩定性的限制[30]。以SF保留率為指標，評價游離和微膠囊形式的SF在60 ℃條件下的穩定性。由圖6可知，所有樣品隨加熱時間的延長保留率都呈現不同程度的下降，24 h時SF保留率為CS-SF（未檢測到）＜Zein/CS-SF＜游離SF＜Gel-SF＜Zein/Gel-SF＜Zein-SF。游離狀態下的SF損失較為嚴重，僅剩20.14%；CS-SF和Zein/CS-SF微膠囊SF檢出率低，可能是因為微膠囊粒徑較小，一部分SF吸附到表面，暴露在高溫環境中降解，或者是由于CS的導熱性使內部SF損失。Zein-SF、Gel-SF、Zein/Gel-SF微膠囊的SF保留率在80%左右，SF穩定性明顯提高，可能是微膠囊化的SF受壁材的保護其結構未被直接破壞，表明有效的微膠囊化可以使SF避免高溫降解。

圖6 游離和微膠囊形式的SF在60 ℃下的熱穩定性Fig.6 Thermal stability of SF in free and encapsulated forms at 60 ℃

Wu Yuanfeng等[4]通過噴霧干燥將由5 種不同壁材料制成的樣品在35 ℃下貯存，研究微膠囊的貯存穩定性，也發現SF穩定性受壁材選擇的影響很大，阿拉伯膠/β-環糊精微膠囊化對SF的保留率遠低于麥芽糊精包合物。但不可否認的是，有效的微膠囊化確實可以提高活性物質的穩定性，Fahey等[31]將SF/α-環糊精包合物與游離SF分別在室溫與高溫下長時間放置，發現包合物中的SF更穩定。毛瑩等[32]以海藻酸鈉為壁材，經研究發現基于內源乳化法制備的花色苷微膠囊有效提高了其對溫度的穩定性?？梢缘贸鼋Y論：Zein-SF、Gel-SF、Zein/Gel-SF微膠囊發揮了載體對目標成分的保護作用，能夠有效減少熱對SF的影響，提高其熱穩定性，有利于延長SF貨架期和進一步加工利用。

3 結 論

Zein和Gel可用作靜電噴霧包封SF的壁材，SEM觀察結果顯示Zein-SF和Gel-SF微膠囊表面光滑完整，整體呈球狀結構，微膠囊大小均勻；Zein-SF和Gel-SF微膠囊包封率均高于95%；FTIR譜圖表明Zein-SF和Gel-SF微膠囊中SF被成功包封；熱重分析曲線表明Zein-SF和Gel-SF微膠囊有較高的熱穩定性；體外模擬實驗結果表明，以Zein和Gel為壁材制備的SF微膠囊具有良好的胃腸溶解和釋放性能；另外，穩定性實驗說明經微膠囊化處理后的SF對溫度的穩定性有顯著提高?？傊?，Zein和Gel通過靜電噴霧技術可以形成有效的SF遞送載體，有利于促進SF的產業化應用。