超聲復合堿處理對大豆分離蛋白乳化性影響及其對表沒食子兒茶素沒食子酸酯保護作用

閆世長，徐靜雯，武利春，孫禹凡，齊寶坤,，李 楊,2,3,

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.哈爾濱市食品產業研究院，黑龍江 哈爾濱 150000；3.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江 哈爾濱 150000）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）主要是由7S（β-伴球蛋白）和11S（球蛋白）兩種球形蛋白組成，可以提供包括賴氨酸在內的必需氨基酸，其具有較高的營養價值[1]。然而，未改性的SPI其功能特性如乳化特性、凝膠特性及其他加工特性等[2]的應用常常受限。SPI相對較低的乳化性可能是由7S和11S球蛋白三級和四級結構的復雜性、緊密堆積的球形構象以及低分子柔韌性引起的[1]。因此，需要對SPI進行修飾處理以獲得更優的乳化特性，這對其作為功能性和營養性成分在食品和藥品中的應用有著重要的意義。

近年來，酸堿處理、超聲處理被廣泛用于蛋白改性。酸堿處理主要是依靠產生的靜電斥力來引起分子結構展開[3]。超聲處理通過產生機械作用、空化作用來促使蛋白肽鍵斷裂、破壞蛋白聚集顆粒間的非共價作用，從而引起天然蛋白分子聚集狀態的改變[4]。Jiang Lianzhou等[5]研究發現超聲處理黑豆蛋白可使蛋白的亞基發生解離、疏水基團暴露、乳化特性增加。Zhang Zhaoli等[6]研究發現堿處理可以使蛋白亞基解離、二硫鍵斷裂，從而改善其功能特性。然而，單一的改性方式對蛋白功能特性的提升效果并不理想，近年來，復合改性方法引起了人們的關注。Jiang Shanshan等[7]研究發現超聲復合酸處理可改變豌豆蛋白的結構，從而提升其功能性。Li Suyun等[8]研究發現超聲復合堿處理可使大米蛋白的α-螺旋含量減少，無規卷曲含量增加，導致結構變得松散。然而，目前關于超聲復合堿處理對SPI的影響還鮮見報道。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（(-)-epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶多酚的主要成分。EGCG富含酚羥基，具有強抗氧化活性，并可在預防癌癥、心血管疾病以及其他慢性疾病方面發揮作用[9]。但是，EGCG在中性和堿性溶液中非常不穩定，隨著pH值、氧氣濃度或溫度的升高，EGCG降解速度加快[10]。因此，尋找理想的方法防止EGCG降解迫在眉睫，Chen Weijun等[11]利用堿處理改性的乳清蛋白與EGCG結合，顯著提高了乳清蛋白與EGCG的結合力，阻止了EGCG在貯存過程中的降解。Shpigelman等[12]研究發現熱改性的乳蛋白與EGCG的結合能力增強，有效降低了EGCG的降解速度。然而，關于超聲復合堿處理SPI對EGCG的保護作用目前鮮見報道。因此，本實驗旨在研究超聲復合堿處理對SPI分子結構及功能特性的影響及其對EGCG的保護作用，以期為SPI作為生物活性成分載體的設計提供理論和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；EGCG（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（1-anilino-8-naphthalene-sulfonate，ANS）美國Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3C型實驗室pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；F-6000熒光分光光度計 日本Hitachi公司；TU-1800紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；JJ-1增力電動攪拌器 江蘇金城國勝儀器廠；Allegra64R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備與處理

1.3.1.1 SPI制備

根據Li Yang等[13]的方法制備SPI。將大豆磨粉，過60 目篩，用正己烷脫脂，將脫脂豆粉分散于去離子水中（1∶10，m/V），用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至9.0，攪拌1 h，9 000 r/min離心30 min，取其上清液，然后用2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.5，得到蛋白沉淀物，將蛋白沉淀物水洗如何溶解3 次，6 500 r/min離心30 min得到沉淀物，將沉淀物用蒸餾水溶解后，用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至中性，凍干，即得SPI，使用凱氏定氮法測定蛋白質量分數，為（92.35±0.26）%。

1.3.1.2 SPI處理

根據Hu Hao[14]與Huang Liurong[15]等的方法對SPI進行處理。

對照組：稱取SPI 1.0 g，加入蒸餾水100 mL，25 ℃攪拌1 h，攪拌過程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為7.0，在5 000 r/min下離心15 min得上清液，然后凍干。

堿處理：稱取SPI 1.0 g，加入蒸餾水100 mL，25 ℃攪拌1 h，攪拌過程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為12.0，然后調節pH值至7.0保持1 h，在5 000 r/min下離心15 min得上清液，然后凍干。

超聲處理：稱取SPI 1.0 g，加入蒸餾水100 mL，25 ℃攪拌1 h，攪拌過程中利用0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為7.0，然后200 W超聲處理5 min（工作/間歇時間比為5 s/5 s），蒸餾水定容到100 mL，在5 000 r/min下離心15 min得上清液，然后凍干。

超聲復合堿處理：稱取超聲處理的SPI 1.0 g，加入100 mL蒸餾水，25 ℃攪拌1 h，并用濃度為0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值為12.0，然后調節pH值至7.0，保持1 h，在5 000 r/min下離心15 min得上清液，然后凍干。

超聲處理、堿處理、超聲復合堿處理的樣品分別記作USPI、HSPI、UHSPI。

1.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

用IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀在室溫下記錄SPI的紅外光譜。將樣品與KBr混合（質量比1∶100），然后壓片。在500～4 000 cm-1的范圍內記錄光譜，分辨率為4 cm-1。采用Peakfit 4.12軟件中高斯曲線擬合α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲的特征峰[16]，分析其相對含量。

1.3.3 熒光光譜分析

根據He Zhiyong等[17]的方法并稍作修改，對SPI進行熒光光譜分析，使用F-6000熒光分光光度計，在連續掃描模式下，發射光譜范圍為200～500 nm，激發波長設定為200～350 nm，共進行16 次掃描。

1.3.4 巰基含量測定

巰基含量參照Lee等[1]的方法進行測定。將15 mg樣品溶解于5.0 mL的緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）中，在該蛋白液中加入50 μL的Ellman試劑，漩渦混勻后在室溫（（25±1）℃）下反應1 h，然后再經10 000×g離心15 min。得到的上清液在412 nm波長處測定吸光度，以未加蛋白的Ellman試劑為空白。巰基含量以DTNB摩爾消光系數13 600 L/（mol·cm）計算，單位為μmol/g。

1.3.5 表面疏水性測定

采用Kang Dacheng等[18]的方法，以ANS為熒光探針測定的蛋白質表面疏水性。利用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L、pH 7.0）將各處理蛋白配制成2 mg/mL的蛋白溶液。然后用磷酸鹽緩沖液將蛋白質量濃度稀釋至0.005～0.500 mg/mL之間。取不同質量濃度的稀釋樣品4 mL，加入50 μL的ANS溶液（采用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制成，濃度8 mmol/L）。采用F-6000型熒光分光光度計在365 nm的激發波長和484 nm的發射波長處測定樣品的熒光強度，以熒光強度為縱坐標、蛋白質量濃度為橫坐標作圖，曲線斜率即為蛋白質分子的表面疏水性。

1.3.6 乳化性測定

乳化性的測定參考Gao Hao等[19]的方法并稍作修改。將1.3.5節樣品溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋（10 mmol/L、pH 7.0）至質量濃度為1 mg/mL，將稀釋的樣品以3∶1（V/V）溶解于大豆油中，使用高速剪切均質機以10 000 r/min均質1 min形成乳狀液，立即從乳狀液底部提取50 μL乳液分散于質量分數0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液，稀釋100 倍。經漩渦振蕩后用分光光度計在500 nm波長處測定樣品的吸光度A500nm，用相同質量分數的十二烷基硫酸鈉溶液作為對照。經10 min后再次測定其吸光度。用吸光度表示乳化活性，A500nm越高表示乳化活性越高；按公式（1）計算乳化穩定性。

式中：A0、A10分別為乳狀液在0、10 min時的吸光度。

1.3.7 熒光猝滅分析

根據Chen Weijun等[11]的方法，向10 mL不同方式處理的SPI溶液（1 mg/mL）中分別逐滴加100 μL 2.5×10-6、5.0×10-6、7.5×10-6、10.0×10-6、12.5×10-6、15.0×10-6、17.5×10-6、20.0×10-6mol/L的EGCG溶液，漩渦振蕩后，選擇激發波長280 nm、激發狹縫5 nm、掃描速率600 nm/min、連續掃描記錄發射波長300～400 nm。熒光猝滅一般可分為動態猝滅和靜態猝滅2 種作用機制。應用Stern-Volmer方程判斷猝滅類型[20]，見公式（2）。

式中：F0和F分別為未加入和加入猝滅劑EGCG時SPI溶液的熒光強度；[Q]為EGCG的濃度/（10-6mol/L）；Kq為雙分子猝滅速率常數/（L/（mol·s））；Ksv為動態猝滅常數/（L/mol）；τ0為猝滅劑不存在時熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s。

一般情況猝滅劑對于生物大分子最大猝滅速率常數為2×1010L/（mol·s），當大于這一速率時，則為靜態猝滅，靜態猝滅按公式（3）計算。

式中：Ka為表觀結合常數/（L/mol）；n為結合位點數。

1.3.8 EGCG穩定性測定

通過將EGCG溶液（0.5 mg/mL，溶解于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，pH 7.0）和SPI溶液（1 mg/mL，溶解于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）以1∶1的體積比混合制備SPI-EGCG復合物。使用相同的緩沖液制備游離EGCG溶液（0.25 mg/mL）。將所有樣品在室溫下放置7 d。在425 nm波長處測定其吸光度[12]，以吸光度表示EGCG的穩定性。

1.4 數據統計與分析

所有實驗重復3 次，結果采用平均值±標準差表示。利用SPSS 20軟件中的方差分析法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。利用Origin 2020軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SPI的傅里葉變換紅外光譜分析結果

圖1 超聲與堿處理SPI的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.1 Fourier transform infrared spectra of native and treated SPI

表1 超聲與堿處理SPI的二級結構相對含量Table 1 Relative contents of secondary structures in native and treated SPI%

傅里葉變換紅外光譜常被用來分析蛋白質二級結構的變化情況。由圖1可知，經過不同條件處理后，各樣品酰胺I帶的半峰寬變窄、強度減弱及峰位（SPI：1 631.73 cm-1；HSPI：1 632.81 cm-1；USPI：1 633.02 cm-1；UHSPI：1 633.48 cm-1）發生改變，由此可知SPI二級結構發生變化。SPI二級結構相對含量分析如表1所示，與對照組相比，堿處理可以使蛋白的α-螺旋與β-折疊相對含量降低，這可能是堿處理提高靜電斥力導致的[21]。Chen Weijun等[11]發現堿處理可以降低乳清蛋白蛋白的α-螺旋與β-折疊含量，這與本實驗結果一致。超聲處理SPI的α-螺旋相對含量顯著降低，表明超聲波可以破壞蛋白質分子的氫鍵和蛋白的剛性結構，并改善蛋白質分子柔性[19]。此外，與對照組相比，超聲輔助堿處理的SPIα-螺旋相對含量顯著降低（降低13.23%）、無規卷曲含量顯著升高（升高8.44%），可能是由于蛋白質表面的氫鍵含量減少和堿處理提供的靜電相互作用降低了蛋白質的穩定性[22]。

2.2 SPI的熒光光譜分析結果

圖2 超聲與堿處理SPI的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of native and treated SPI

色氨酸在280 nm波長處具有最大吸收峰，因此可通過280 nm激發波長處的熒光強度變化考察蛋白內部色氨酸的變化。SPI含有一定數量的色氨酸，當色氨酸存在于天然蛋白質內部時，熒光強度降低，熒光峰位會發生藍移，當蛋白質結構展開時，熒光強度增加，熒光峰位會發生紅移[23]。本研究利用熒光光譜來表征蛋白三級結構的變化，如圖2所示，與對照蛋白相比，堿處理的SPI沒有發生明顯的紅移或藍移現象，但是其熒光強度明顯增加，這是由于堿誘導促使蛋白分子結構展開，使內部的發色基團暴露[11]。超聲處理的SPI熒光強度增加并發生明顯的紅移現象，這是由于超聲產生的空化作用或機械剪切應力導致蛋白結構變得松散，內部的芳香族氨基酸暴露出來，造成熒光強度增加[8]。超聲輔助堿處理與單獨的超聲或堿處理相比，其熒光強度進一步增加，表明超聲與堿處理有協同作用，可以使蛋白結構發生解折疊，使疏水基團暴露，熒光強度增加[24]。

2.3 SPI的表面疏水性分析結果

表面疏水性是蛋白質一種重要的表面性質，與蛋白的乳化特性相關。如圖3所示，與對照蛋白相比，超聲處理的SPI表面疏水性顯著增加（P＜0.05），可能是因為超聲波產生的空化作用破壞了蛋白質分子空間結構，暴露出分子內部的疏水性氨基酸殘基，這些疏水性基團吸附在蛋白質表面，導致蛋白質的表面疏水性增加[7]。堿處理的SPI表面疏水性也發生顯著的變化（P＜0.05），這是因為堿誘導使蛋白質二硫鍵遭到破壞，亞基發生解離，造成包埋在分子內部的疏水基團暴露在分子表面，進而導致表面疏水性增加[11,21]。超聲處理SPI比堿處理SPI表面疏水性增加程度更顯著，這可能是恢復到中性條件時，蛋白結構發生部分重新折疊，部分疏水基團被重新包裹在蛋白內部[7,21]。超聲輔助堿處理的SPI與單獨超聲處理或堿處理相比，其表面疏水性增加更顯著，這表明超聲處理產生的空化作用與堿處理提供的靜電斥力相輔相成，使難溶的SPI結構展開，暴露出更多的疏水作用位點，增加了蛋白的表面疏水性[19]。

圖3 超聲與堿處理SPI的表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of native and treated SPI

2.4 SPI的巰基含量分析結果

圖4 超聲及堿處理SPI的巰基含量Fig.4 Sulfhydryl contents of native and treated SPI

蛋白質巰基含量的變化也表征著蛋白質結構的改變，巰基含量的測定結果如圖4所示，與對照組相比，超聲處理的SPI巰基含量增多，可能的原因是超聲處理后蛋白質空間結構被破壞，蛋白內部的巰基基團暴露出來[1]。堿處理的SPI巰基含量也增加，可能是堿處理使蛋白質二硫鍵遭到破壞，亞基發生解離，進而使巰基含量增加[7,21]。超聲輔助堿處理的SPI與單獨超聲或單獨堿處理SPI相比，其巰基含量顯著增加（P＜0.05），這可能是超聲與堿處理產生協同作用，使蛋白的結構變得松散，亞基發生解離，二硫鍵斷裂，內部的巰基基團暴露出來[25]。

2.5 SPI的乳化性分析結果

乳化活性與乳化穩定性是表征蛋白乳化能力與穩定乳狀液能力的重要指標，其中乳化活性表示蛋白乳液形成油-水界面的能力，乳化穩定性是指乳狀液形成小液滴的穩定能力[26]。由圖5可知，與對照SPI相比，單獨堿處理的SPI乳化活性與乳化穩定性顯著增加，可能是由于pH 12距離蛋白的等電點較遠，產生較高的靜電斥力，蛋白分子間的相互作用減弱，粒徑分布均勻，表面疏水性增加，從而改善其乳化特性[7,19]。單獨超聲處理的SPI乳化活性與乳化穩定性也呈現顯著增加趨勢，可能是由于超聲處理破壞蛋白質分子的空間結構，使SPI分子展開，暴露出埋藏在分子內部的疏水性基團，促進了SPI在油-水界面上的展開，有利于形成穩定的網絡結構[27]。超聲輔助堿處理的蛋白表現出最高的乳化活性（1.714）與乳化穩定性（364.68 min），這可能是堿處理產生的靜電斥力使蛋白結構變得松散，疏水性基團暴露，同時超聲處理可以使蛋白形成穩定的膠束包裹在油滴表面，進而提升蛋白的乳化性[24]。

圖5 超聲及堿處理SPI的乳化活性與乳化穩定性Fig.5 Emulsifying activity and emulsion stability of native and treated SPI

2.6 SPI的熒光猝滅分析結果

蛋白質熒光圖被認為是研究多酚與蛋白質相互作用和結合的實用工具。本實驗采用熒光猝滅光譜法評價EGCG與SPI在pH 7.0下的相互作用，結果如圖6所示。隨著EGCG濃度的增加，SPI、HSPI、USPI、UHSPI的熒光強度降低，并發生輕微紅移，這一結果表明EGCG的加入改變了蛋白的結構，使疏水性基團進一步暴露[11]。其中，超聲輔助堿處理的SPI與EGCG相互作用，其熒光損失率最大。

圖7A為不同濃度EGCG猝滅超聲及堿處理SPI的Stern-Volmer圖，其猝滅相關常數如表2所示，SPI、HSPI、USPI、UHSPI的雙分子猝滅速率常數分別為1.390×1012、2.060×1012、2.450×1012、3.150×1012L/（mol·s），其均高于最大動態猝滅速率常數（2×1010L/（mol·s）），因此SPI、HSPI、USPI、UHSPI與EGCG之間的猝滅為靜態的。Kq和Ksv反映了生物分子與猝滅劑的結合強度，較高的Kq和Ksv可能表明生物分子與猝滅劑更易結合[20]。對于靜態猝滅，用式（3）計算表觀結合常數（Ka）和結合位點數（n），結果如圖7B和表2所示，超聲輔助堿處理的SPI顯示出最大的表觀結合常數（6.560×104L/mol）與結合位點數（1.43），表明UHSPI對EGCG具有更大的結合力。由于蛋白質與多酚的相互作用與蛋白質的表面性質明顯相關，蛋白質結構的變化可能會影響多酚的結合反應，Chen Weijun等[11]研究發現，堿處理可以改變乳清蛋白的結構，進而增強蛋白與EGCG之間的結合力；此外，Shpigelman等[12]還提出，蛋白與EGCG結合強度的增加可能是熱處理使蛋白的疏水基團暴露進而與EGCG發生疏水性結合所致，因此，超聲輔助堿處理的SPI有著最強的結合能力可能是由于其結構變化，這與本實驗前面結構變化討論的結果一致。

圖6 EGCG對SPI的熒光猝滅Fig.6 Fluoresecence quenching of native and treated SPI in the presence of EGCG

圖7 EGCG猝滅超聲及堿處理SPI的Stern-Volmer圖（A）及雙對數圖（B）Fig.7 Stern-Volmer plot (A) and double logarithm plot (B) of fluorescence quenching of native and treated SPI in the presence of EGCG

表2 SPI-EGCG復合物的雙分子猝滅速率常數、動態猝滅常數、表觀結合常數和結合位點數Table 2 Fluorescence quenching rate constant, dynamic quenching constant, apparent binding constant and binding site number of SPI-EGCG complex

2.7 EGCG的穩定性分析結果

圖8 EGCG與不同處理SPI復合后的貯藏穩定性Fig.8 Storage stability of EGCG complexed with native or treated SPI

多酚易受環境壓力的影響，從而發生氧化形成帶有顏色的醌類物質，因此，研究多酚物質的降解情況可以有效防止其發生降解，進而提高其利用率[28]。圖8顯示了在室溫下貯存7 d期間對照組、HSPI、USPI和UHSPI對EGCG降解的保護情況?？梢钥闯?，隨著貯藏時間的延長，游離EGCG的吸光度迅速上升，這表示EGCG發生了氧化降解[29-30]。SPI與EGCG復合后，其吸光度輕微降低，表明SPI對EGCG有較弱的保護能力，可能與蛋白的結構及與EGCG的結合強度有關，EGCG與超聲處理、堿處理以及超聲輔助堿處理的SPI復合之后，其吸光度與對照組相比均進一步降低；其中，超聲輔助堿處理展現出最好的保護作用，這可能與UHSPI具有較高的巰基含量及與EGCG較強的結合能力有關。Bae等[31]的研究表明蛋白質的巰基可以作為抗氧化劑，從而抑制EGCG的氧化降解。Shpigelman等[12]研究發現熱處理的蛋白結構發生改變，與EGCG的結合強度增加，能夠保護EGCG不被降解。Chen Weijun等[11]還指出，堿處理的乳清蛋白與EGCG的結合位點數增加，從而提高了EGCG的抗氧化性并延緩其降解速率。

3 結 論

本研究探究了超聲復合堿處理SPI結構、功能的變化及其對EGCG的保護作用，結果發現，超聲復合堿處理中堿處理可以誘導蛋白分子展開，同時超聲提供的機械剪切及空化作用使蛋白分子結構變得更松散，暴露出更多的疏水性基團，比單一處理的方式更有效；堿處理、超聲處理、超聲復合堿處理均可以提高蛋白的乳化特性，超聲復合堿處理的效果最佳；熒光猝滅光譜分析結果表明，超聲復合堿處理的SPI與EGCG具有最強的結合能力，結合位點數最多（1.43）；堿處理、超聲處理、超聲復合堿處理均可以防止EGCG氧化，超聲復合堿處理的保護效果最優。本研究可為SPI在食品工業中作為乳化劑和功能性活性物質載體的應用提供理論參考。