西藏貓乳總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝及其抗氧化活性研究

周忠會 周子琪 索朗歐珠

【摘 要】 目的：使用大孔吸附樹脂分離純化西藏貓乳總黃酮，并對純化后的總黃酮進行體外抗氧化活性研究。方法：通過靜態吸附實驗考察ADS-F8、D101、AB-8等8種大孔吸附樹脂對西藏貓乳總黃酮的純化效果，并研究樣液質量濃度、pH值、上樣體積對樹脂吸附率的影響以及洗脫液濃度、體積對洗脫率的影響。采用DPPH法、ABTS法和FRAP法，評價純化后西藏貓乳總黃酮的抗氧化活性。結果：采用ADS-F8型樹脂對西藏貓乳進行分離純化，最佳工藝條件為：上樣濃度0. 6mg/mL，pH為3.0，體積23BV，洗脫劑為60%的乙醇，洗脫體積8BV。所得西藏貓乳總黃酮純度由17.18%提高至24.67%，精制倍數為1.44?？寡趸瘜嶒灲Y果表明，純化后西藏貓乳總黃酮對ABTS自由基的清除率可以達到99.15%，DPPH自由基清除率也可達到67.84%，體現出良好的自由基清除能力，并對Fe3+有較好的還原力，FRAP值最高為939.8mol/L。結論：ADS-F8型樹脂可對西藏貓乳總黃酮進行分離純化，提高總黃酮純度，純化后的總黃酮具有較強的抗氧化作用。

【關鍵詞】 大孔吸附樹脂;西藏貓乳;總黃酮;純化;抗氧化

【中圖分類號】R285 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2021）1-0041-07

Purification of Total Flavonoids from Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch. by Macroporous Adsorption Resin and Its Antioxidant Activity

ZHOU Zhonghui ZHOU Ziqi SUO Lang ouzhu

Tibet Vocational Technical College，Lasa 850025，China

Abstract：Ojective Separation and purification of total flavonoids from Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch.by macroporous adsorption resin， and the antioxidant activity of the total flavonoids was studied in vitro. Methods Purification of total flavonoids from Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch.by eight macroporous adsorptive resins such as ADS-F8， D101 and AB-8， was investigated by static adsorption experiments， and the effect of sample liquid mass concentration， pH value and sample volume on resin adsorption rate was investigated， as well as the effect of eluate concentration and volume on elution rate. The antioxidant activity of purified total flavonoids from Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch. was evaluated by DPPH， ABTS and FRAP methods. Results Separation and purification of Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch. by ADS-F8 Resin， the optimum technological parameters as follows： the concentration of the sample 0.6mg/mL， pH 3.0， the volume 23 BV， the eluting regent 60 % ethanol， and the volume of elution 8 BV. The total flavone content of Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch. increased from 17.18% to 24.67%， and the refining multiple was 1.44. The results of antioxidant test showed that the scavenging rate of ABTS and DPPH free radicals of total flavonoids from Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch. could reach 99.15% and 67.84% respectively， which showed good free radical scavenging ability and good reducing power to Fe3+. The highest FRAP value was 939.8moL/L. Conclusion ADS-F8 resin can be used to separate and purify the total flavonoids from Rhamnella gilgitica Mansf. and improve the purity of total flavonoids. The purified flavonoids have strong antioxidant effect.

Keywords：Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch.; Total Flavonoids; Macroporous Resin;Purification; Antioxidant Activity

西藏貓乳（Rhamnella gilgitica Mansf. et Melch.）為鼠李科貓乳屬植物，主要分布于我國西藏東南部、云南西北部、四川西南部，其莖的干燥木質部可入藥，具有燥濕、活血的作用，主治類風濕性關節炎、黃水病和高山多血病等癥[1]。研究表明，西藏貓乳中主要含有柚皮素、山萘酚、槲皮素、墨沙酮、花旗松素等黃酮類化合物[2-3]。這些黃酮類化合物多具有抗炎、抗氧化、抗菌等作用，是西藏貓乳的主要活性成分[4]。

目前，西藏貓乳的提取主要采用水提法或醇提法[5]，所得產物雜質較多，純度較低，有必要尋找一種高效便捷的技術對總黃酮進行純化。大孔吸附樹脂因具有對有機組分的選擇性高、機械強度高、價格低廉、再生方便等特點，己廣泛用于天然產物的分離純化[6-7]。但目前還未有大孔樹脂純化西藏貓乳總黃酮的報道。

本研究選用不同型號的大孔吸附樹脂分離純化西藏貓乳總黃酮，通過靜態吸附與解吸附及動態吸附與解吸附實驗考察其分離純化工藝[8]，并對抗氧化活性進行評價，旨在為西藏貓乳的進一步開發利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 西藏貓乳（西藏芒康地區，經西藏職業技術學院任軍輝副教授鑒定，為鼠李科貓屬植物西藏貓乳Rhamnella gilgitica Mansf.et Melch）;蘆丁標準品（中國生物制品檢定所，批號：100080-00707）;HPD-100、D101、AB-8、HPD-750、HPD-200L、HPD-600、ADS-F8、NKA-9型大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）;95%乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180915）、亞硝酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180102）、硝酸鋁（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180208）、鹽酸（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180316）、氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20110331）等試劑均為分析純。

1.2 儀器 HH-4型數顯恒溫水浴鍋（常州天瑞儀器有限公司）;SHA-CA型數顯恒溫水浴振蕩器（常州賽普實驗儀器廠）;101-B型數顯鼓風干燥箱（上海葉拓儀器儀表有限公司）;N-1110型旋轉蒸發儀（上海泉杰儀器有限公司）;SHD-（D）型循環水式多用真空泵（青島蘭特思科教儀器有限設備公司）;HPS-3C型PH測試儀（上海雷磁儀器有限公司）;YP202N型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）;L7雙光束紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 西藏貓乳總黃酮的提取 精密稱取西藏貓乳粗粉30.0g于燒瓶中，加900mL水加熱回流提取2次，每次提取1.5h，合并提取液，置于旋轉蒸發儀濃縮至100mL，置于燒杯中，得到西藏貓乳提取液，4℃儲藏備用。

2.2 西藏貓乳總黃酮的純度測定

2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品0.0320g，用60%乙醇溶解，定容于100mL的容量瓶，搖勻后得到蘆丁標準溶液。準確吸取標準液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL的量瓶中，分別加入60%乙醇使至5.0mL，再分別加入5%的NaNO2溶液0.3mL，搖勻，靜置6min后加入10%的Al（NO3）3溶液0.3mL，搖勻，靜置6min后加入4% NaOH溶液10.0mL，最后用體積分數為60%乙醇定容至25mL，靜置15min。以空白液為對照品，使用紫外分光光度計于510nm波長處測量其吸光度。以蘆丁標準品溶液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線方程y=9.0811x+0.0701（R2 = 0.9999），線性范圍為0～0.1mg/mL。

2.2.2 精密度 精密移取蘆丁對照品溶液2mL，按2.2.1項下方法，同法測定吸光度，重復測定6次，記錄吸光度值。計算RSD值，結果顯示 RSD=0.78%，表明該方法、儀器的精密度較好。

2.2.3 穩定性 取同一西藏貓乳提取液1mL，按2.2.1項下方法，每隔10min同法測定1次吸光度，記錄120min內提取液的吸光度值。結果表明該供試品溶液在120 min內保持穩定，RSD值為0.44%。

2.2.4 重復性 取同一批供試品西藏貓乳粗粉6份，每份約30g，精密稱定，按2.1項下方法制備提取液，分別精密移取提取液1mL，按2.2.1項下方法，同法測定，記錄吸光度值。結果顯示RSD=1.18%，表明該測定方法重復性較好。

2.2.5 加樣回收實驗 取已測總黃酮含量的西藏貓乳粗粉6份，每份約15g，精密稱定，分別精密加入30.0mg蘆丁標準品，按“2.1”項下方法處理，于510nm處測定，計算回收率。得到平均回收率為99.78%，RSD值為0.40%，結果表明此法回收率良好。

2.2.2 西藏貓乳提取液中總黃酮濃度的測定 取適量西藏貓乳提取液按標準曲線測定方法操作，顯色后在510nm波長處測定其吸光度，代入標準曲線方程計算樣液中黃酮的質量濃度，得到西藏貓乳提取液中總黃酮濃度為0.6mg/mL。

2.3 大孔吸附樹脂純化西藏貓乳總黃酮

2.3.1 大孔吸附樹脂的預處理 將8種樹脂（HPD-100、D101、AB-8、HPD-750、HPD-200L、HPD-600、ADS-F8、NKA-9）用95%乙醇浸泡24h，使其充分溶脹，傾倒上層懸浮顆粒和乙醇，再使用蒸餾水洗至樹脂無醇味，保存備用[9]。

2.3.2 大孔吸附樹脂的選擇 準確稱取處理好的8種樹脂各2.0g于100mL具塞錐形瓶中，分別加入50mL黃酮濃度為0.6mg/mL的西藏貓乳提取液，恒溫恒速振蕩吸附24h，取上清液，測定上清液總黃酮濃度，并按式①分別計算8種樹脂對黃酮的吸附率。將吸附飽和的樹脂過濾后，用去離子水洗至洗滌液無色，分別加入75%乙醇20mL，恒溫恒速振蕩解吸附24h，取上清液，測定上清液總黃酮濃度，并按式②分別計算8種樹脂的洗脫率[10]。

吸附率（%）=C0-C1C0×100%①

洗脫率（%）=C2-V2（C0-C1）V1×100%②

式中，C0為樣液黃酮初始質量濃度（mg/mL）;C1為吸附飽和后樣液黃酮質量濃度（mg/mL）;C2為解吸液黃酮質量濃度（mg/mL）;V1為吸附液體積（mL）;V2為解吸液體積（mL） 。

8種大孔樹脂對西藏貓乳總黃酮的靜態吸附和解吸能力有所不同，這與大孔樹脂的極性、平均孔徑和比表面積有關[11]。結果如圖2所示，其中ADS-F8型樹脂對總黃酮的吸附率為94.56%、解吸附率為84.64%，吸附與解吸附效果優于其他七種樹脂，這是由于ADS-F8型樹脂極性與西藏貓乳中黃酮類化合物極性較為接近，故選用ADS-F8型樹脂分離純化西藏貓乳。

2.3.3 大孔吸附樹脂純化西藏貓乳總黃酮工藝優選

2.3.3.1 樣液pH對樹脂吸附率的影響 準確量取6份西藏貓乳提取液各50mL置于燒杯中，用0.1mol/mL鹽酸溶液調節至pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的樣液。稱取6份預處理后的ADS-F8樹脂置于具塞錐形瓶中，分別加入不同pH值樣液，于25 ℃、120r/min振蕩吸附24h，吸附飽和后，取上清液測定其總黃酮濃度，計算樹脂吸附率。

由圖3可知，在酸性條件下樹脂吸附率較高，當樣液pH為3.0時，吸附率最大，這可能是因為黃酮具有酚羥基結構，在酸性條件下以分子狀態存在，有利于大孔樹脂與黃酮之間進行物理吸附，但黃酮一般顯弱酸性，在樣液pH值太低的情況下，樣液中的部分黃酮會析出，導致樹脂的吸附率降低[12]，因此在樣液pH值為2時樹脂的吸附率低于pH值為3時，而隨著堿性增強，黃酮易解離成酸根離子，吸附作用降低[13]。因此，選擇樣液的最佳pH值為3.0。

2.3.3.2 樣液濃度對樹脂吸附率的影響 取等體積、總黃酮濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL的西藏貓乳提取液，調節pH至2～3，準確稱取6份預處理后的ADS-F8樹脂各2.0g置于具塞錐形瓶中，分別加入配置的不同濃度樣液，振蕩吸附24h，吸附飽和后，取上清液測定其總黃酮濃度，計算樹脂吸附率。

由圖4可知，隨著上樣濃度的增大，吸附率先增大后減小，當濃度為0.6mg/mL時，吸附率達到最大值，并隨著濃度的進一步增加而略有降低，這是因為隨著樣液濃度增加，與大孔樹脂單位表面積接觸的黃酮越多，吸附效果越好[14];但樣液濃度過高，雜質含量也增加，樹脂容易堵塞[15]，考慮到實驗效率的問題，故選擇上樣濃度為0.6mg/mL。

2.3.3.3 洗脫液濃度對解析率的影響 準確稱取預處理后的ADS-F8樹脂置錐形瓶中，分別加入總黃酮濃度為0.6mg/mL、pH為2～3的西藏貓乳提取液50mL，振蕩吸附24h，吸附飽和后，取上清液測定其總黃酮濃度。將吸附飽和的樹脂過濾后，洗滌，分別加入50mL濃度為50%～90%的乙醇，振蕩解吸附，測定洗脫液總黃酮濃度，計算樹脂解吸附率[16]。

由圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，解吸率升高，當濃度達到60%時，解吸率達到最大值，濃度繼續增加，解吸率反而降低。原因可能是西藏貓乳總黃酮在60%乙醇中溶解度達到最高，吸附在樹脂上的黃酮更容易解吸下來，但是乙醇體積分數過高，使大量醇溶性雜質也隨之洗脫下來，反而導致洗脫率降低。因此，選擇60%乙醇溶液作為最佳洗脫劑。

2.3.3.4 上樣液體積對樹脂吸附作用的影響 準確稱取ADS-F8樹脂各2.0g，濕法裝柱（柱體積為50mL）。取總黃酮濃度為0.6mg/ mL、pH為3.0的西藏貓乳提取液以1mL/min的流速上樣，收集流出液，每1BV為一個收集段，共收集28BV，測定每段收集液中黃酮的質量濃度，繪制動態泄露曲線[17]。

由圖6可知，當收集到第23份流出液時，流出液中總黃酮開始出現大量的泄漏，一般情況下，流出液的目標物質量濃度為上樣液目標物質量濃度1/10時，認為達到了目標物的泄漏點[18]，由圖可看出泄露點為23BV左右，基于節約原料的原則，選擇上樣量為23BV。

2.3.3.5 洗脫劑用量對解析率的影響 準確稱取預處理后的ADS-F8樹脂2.0g，濕法裝柱，取總黃酮濃度為0.6mg/mL、pH為3.0的西藏貓乳提取液上樣50mL，吸附飽和后，用蒸餾水洗至洗脫液無色，將濃度為60%的乙醇分為50%、60%、70%、80%、90%的體積分數進行洗脫，每1BV為1個收集段，共收集30BV，測定每段洗脫液中總黃酮的質量濃度，繪制動態解吸曲線。

由圖7可知，在開始的2BV，洗脫液中總黃酮質量濃度快速增加，在洗脫體積為2BV時達到最大值，洗脫體積為2～8BV時，總黃酮質量濃度逐漸減少，當洗脫體積為8BV時，洗脫液中總黃酮濃度趨于0，說明洗脫已基本完全。因此，選擇8BV作為最佳洗脫體積。

2.3.4 工藝驗證 取樹脂ADS-F8樹脂3份，采用確定的最佳工藝條件分離純化西藏貓乳總黃酮。對洗脫液進行干燥、稱重，驗證干燥物中總黃酮濃度。

選取ADS-F8型大孔吸附樹脂，取總黃酮濃度為0.6mg/ mL、pH為3.0的西藏貓乳總黃酮提取液以適當流速上樣23BV，用蒸餾水洗至洗脫液無色，60%乙醇以適當流速洗脫，洗脫體積為8BV。結果表明，經過純化后，樣品總黃酮濃度可由原來的17.13%上升至24.67%，精制倍數為1.44。表明此工藝條件適用于西藏貓乳總黃酮的分離純化，且穩定可行。

2.4 西藏貓乳總黃酮體外抗氧化研究

2.4.1 清除DPPH自由基能力 在96孔酶標板中，依次加入不同體積（30～100L）西藏貓乳生藥濃度為2mg/mL的樣品溶液和200L濃度為1mmoL/L的DPPH甲醇溶液，最后用甲醇補齊至總體積300L。室溫避光反應30min，酶標儀測定其吸光度A1，以甲醇代替DPPH溶液測得吸光度A2，以甲醇代替樣品溶液測得空白吸光度A0。以維生素C作為陽性對照，每一濃度做3個平行樣品，取平均值[19]。清除DPPH自由基能力按下式計算：

清除率（%）=（1-A1-A2A0）×100%

由圖8可知，維生素C的抗氧化活性最強。西藏貓乳提取液在不同濃度下的自由基清除率均低于純化后西藏貓乳總黃酮，清除率穩定后仍不足60%，IC50值為1.23mg/mL。純化后西藏貓乳總黃酮的DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而逐漸上升，且在濃度達到1.6mg/mL后趨于穩定，此時清除率達到了65%以上，呈現出良好的清除效果。IC50值略低于純化前，為1.21mg/mL。

2.4.2 清除ABTS自由基能力 將ABTS和高硫酸鉀等體積混合，使用前將混合液在室溫下避光保存12h以上備用。用無水乙醇稀釋混合液直至在734nm處的吸光度為0.700.05，得到ABTS自由基儲備液。西藏貓乳配置成系列濃度樣品溶液，分別取25L不同濃度樣品溶液加入2mL ABTS+溶液，混勻，靜置6min，在734nm處測量吸光度A，以無水乙醇為空白對照，測吸光度A0。用VC作為陽性對照，每一濃度做3個平行樣品，取其平均值[20]。樣品對ABTS自由基清除率按下式計算：

清除率（%）=（A0-A）A0×100%

由圖9可知，純化后的西藏貓乳總黃酮ABTS自由基抑制率在0.5～5mg/mL濃度范圍內逐漸升高，在濃度為5mg/mL時其清除率達到99.15 %，接近于維生素C水平，并高于西藏貓乳提取液，表現出良好的抗氧化活性。純化后的西藏貓乳總黃酮對ABTS自由基清除率的IC50值為1.13mg/mL，低于純化前1.51mg/mL，說明純化后西藏貓乳總黃酮抗氧化活性相比于純化前得到了提升。

2.4.3 FRAP法測定還原能力 將FeSO4溶液，與 TPTZ溶液和醋酸鹽緩沖液混合，吸取該混合液加入96孔板中，酶標儀于593nm讀取吸光值。以FeSO4溶液的濃度為橫坐標，吸光值（A）為縱坐標，進行線性回歸，得到標準曲線曲線方程為y=1.7963x+0.0209（R2=0.9996）[21]，線性范圍為0～0.16mmoL/L。

純化后西藏貓乳總黃酮配置成系列濃度樣品，20mmoL/L FeCl3·6H2O溶液、10mmoL/L TPTZ溶液和醋酸鹽緩沖液按照1∶[KG-*3/5]1∶[KG-*3/5]10的比例混合后，酶標儀于593nm處讀取吸光值A1，在孔中加入20L不同濃度的樣品，8min后于593nm處讀取吸光值A2，A2-A1的差值在標準曲線上獲得與樣品的還原力相當的FeSO4的濃度（μmoL/L），定義為FRAP（Ferric Ion Reducing Antioxidant Power）值。按照上述實驗步驟，計算相同濃度維生素C的FRAP值，每一濃度做3個平行樣品，取平均值。

由圖10可知，純化后西藏貓乳總黃酮的Fe3+還原能力強于西藏貓乳提取液，當生藥濃度到達6mg/mL時，還原能力趨于平穩，濃度為10mg/mL時，有最大還原能力，FRAP值為939.8moL/L。

3 結論

大孔吸附樹脂分離純化技術具有操作方便、分離效果好、再生方便、經濟成本較低一系列優點，廣泛應用于皂苷、生物堿和黃酮成分的分離純化[22]。由于不同型號大孔吸附樹脂的極性、孔徑、比表面積等不同，其分離性質也會有較大差異[23]，故在本研究中，通過對所選8種樹脂進行靜態吸附與解吸附實驗，篩選出ADS-F8樹脂為分離純化西藏貓乳總黃酮的最佳樹脂，并通過單因素考察，最佳純化工藝條件為：樣液濃度0.6mg/mL， pH值3.0，上樣體積23BV，洗脫劑為60%的乙醇，洗脫體積8BV。采用該純化工藝，所得總黃酮的濃度可提高至24.67%。

此次研究考察了純化后西藏貓乳總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力，同時通過FRAP法測定其還原能力。在自由基清除實驗中，純化后總黃酮DPPH 自由基清除率大于65%，清除率相對于提取液有一定提升，純化后西藏貓乳總黃酮IC50值為1.21mg/mL，比純化前有所降低，說明純化后總黃酮對DPPH自由基擁有更好的清除活性;在ABTS實驗中，純化后總黃酮IC50值為1.13mg/ mL，低于西藏貓乳提取液，表明純化后總黃酮的自由基清除率高于西藏貓乳提取液。FRAP法即Fe3還原法，Fe3+還原法是應用較廣泛的抗氧化能力評價方法，可間接評價樣品的抗氧化活性，此次研究中，純化后總黃酮的Fe3+還原能力高于西藏貓乳提取液，證明純化后總黃酮抗氧化能力更顯著。上述抗氧化實驗結果說明，純化后西藏貓乳總黃酮具有良好的抗氧化能力，且抗氧化能力優于西藏貓乳提取液。

綜上，此次研究確定了西藏貓乳總黃酮分離純化相關工藝條件，并且發現純化后的西藏貓乳總黃酮具備良好的抗氧化活性，這為西藏貓乳進一步的研究與開發提供了實驗依據。

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（收稿日期：2020-07-19 編輯：劉斌）