假單胞菌單基因甲基化位點的檢測與自發表型變異分析

葉惠閩，黃顯清，張雪洪

（上海交通大學生命科學技術學院微生物代謝國家重點實驗室，上海 200240）

0 引言

原核生物的表觀遺傳是在不改變DNA 序列的前提下［1］，通過DNA甲基化、組蛋白修飾或RNA沉默［2］等遺傳機制調控特定基因的表達。其中，DNA 甲基化協助調控胞內生理過程是原核生物中表觀修飾的研究熱點，細菌中不同的DNA甲基轉移酶介導的基因表達調控機制具有多樣性［3］。

DNA 甲基化是由DNA 甲基轉移酶（DNA Methyltransferase，MTases）催化，以S-腺苷甲硫氨酸為供體，將甲基基團添加到腺嘌呤或胞嘧啶上［4-5］。DNA甲基化檢測方法發展快速，根據對目標DNA的前處理手段可將檢測技術分為3 類：基于限制性酶切預處理［6］，基于亞硫酸鹽修飾預處理和基于親和富集預處理的甲基化檢測技術［7］。根據檢測目標片段可以分為特異位點的甲基化檢測和全基因組的甲基化分析［8］。

重亞硫酸鹽測序技術（Bisulfite Sequencing PCR，BSP）以高精度的單堿基分辨率和相對較低的檢測成本，可以作為短片段DNA甲基化的檢測技術［9］。其測序利用了DNA片段經重亞硫酸鹽處理氧化變性，而甲基化的胞嘧啶（Cytosine，C）因受到甲基基團保護未被氧化而保持不變［10］。

實際過程中基因組通常只有一小部分具有被甲基化的潛力，故常不需要全基因組甲基化測序，因此建立基因片段的甲基化檢測方法同樣具有廣闊的應用前景。對基因組中富含甲基胞嘧啶的部分來講，BSP 是一種相對節約檢測成本的方法，并且允許測序覆蓋范圍的增加，從而提高探測差異甲基化區域的準確性和便捷度［11］。

綠針假單胞菌HT66 是一株高產吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的菌株。前期研究發現，HT66 高產菌株篩選中所得的表型變異菌株HT66-FLUO 完全喪失了合成PCN的代謝能力，鐵載體的合成能力卻有所增強，對高產菌株的篩選帶來了許多干擾和不便。吩嗪和鐵載體的合成和分泌受到GacA/S 雙組份系統的調控。劉洋等［12］發現HT66 與HT66-FLUO在DNA水平上并無差異，并通過實驗推測HT66-FLUO 的gacS 可能發生了DNA水平的修飾或翻譯后修飾。

為了進一步探究導致HT66-FLUO中GacS蛋白激酶失活的原因，尋找表型變異與全局調控雙元系統GacA/S之間的關系，研究HT66-FLUO在DNA水平上的變異機制。本文建立了一種適合細菌單基因片段的準確、快速的BSP 甲基化測序方法，測定了HT66 和HT66-FLUO中gacS 的甲基化差異位點，為菌株變異機制的闡明提供實驗依據，并為其他細菌中單基因甲基化位點的檢測提供了參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit（QIAGEN，59824）；pTG19-T（Generay，GV6021）；TOPO10（Generay，DL1010）；HiPure Gel Pure Micro Kit（Magen，D2110）；HiPure Bacterial DNA Kit（Magen，D3146）；HiPure Plasmid Maxi Kit（Magen，P1004）；POP7、HI-DI Formamide（Thermo Fisher Scientific，1912674）。NanoDrop-2000 超微量紫外可見分光光度儀（Thermo Fisher Scientific）；電泳儀、凝膠成像系統（上海天能公司）；PCR 儀（ABI）；核算提取儀（NanomagBio）；3730XL測序儀（ABI）

1.2 菌株與引物

本文所用到的菌株、引物和質粒如表1 所示。

表1 本文所用到的菌株、引物和質粒

1.3 培養基和菌株生長條件

綠針假單胞菌HT66 和HT66-FLUO選用LB培養基培養；工程菌株和種子菌株保種和復蘇時使用KB培養基（King’s B液體培養基）［13-14］培養；大腸桿菌使用LB培養基。液體培養基中加入12 g/L的瓊脂粉即為相應的固體培養基。

綠針假單胞菌在恒溫搖床或培養箱中進行培養（28 ℃、180 r/min）。

1.4 微生物菌體收集與總DNA 提取

將甘油凍存保種的綠針假單胞菌HT66 和HT66-FLUO取出，劃線于KB固體培養基中完成第1 輪復蘇活化，培養至約48 h 取合適的單菌落。經KB 培養液多次稀釋后均勻涂布于KB平板完成第2 次活化。將單菌落接種于裝有5 mL LB 液體培養基的玻璃小瓶中，過夜培養。取上述發酵液，每株菌設置3 個平行樣本，分別提取總DNA，具體實驗步驟遵循HiPure Bacterial DNA Kit（Magen，D3146）說明書。將提取到的菌株基因組通過NanoDrop-2000 測定在260 和280 nm的吸收值，對DNA的濃度和質量進行評估。同時，通過瓊脂糖凝膠電泳進一步分析提取的基因組。

1.5 BSP實驗

取上述實驗得到的合格DNA提取樣品，進行亞硫酸鹽轉化等后續試驗，BSP 實驗總過程大致如圖1所示。

圖1 重亞硫酸鹽法測序實驗流程圖［15-16］

1.5.1 亞硫酸鹽轉化實驗試劑準備

BW緩沖溶液：向BW 濃縮液中加入30 mL 無水乙醇，混勻。BD緩沖液：向BD 濃縮液中27 mL 無水乙醇，混勻。

1.5.2 重亞硫酸鹽轉化DNA

亞硫酸鹽處理操作步驟按照試劑盒說明書操作（QIAGEN，cat：59824），取1 μg 基因組DNA 進行亞硫酸鹽轉化并純化回收。重亞硫酸鹽轉換程序如表2所示。

表2 重亞硫酸鹽轉化程序

1.5.3 重亞硫酸鹽轉化后DNA純化

離心PCR管并將液體轉移到1.5 mL 離心管內，加入310 μL 新鮮配制的BL 溶液。渦旋混合均勻后瞬時離心，以下的離心條件均在室溫下進行（15～25℃）。依次添加溶液到離心柱內共洗滌離心5 次，順序為無水乙醇、BW 溶液（洗液）、BD 溶液（脫磺酸基緩沖液）、BW溶液、無水乙醇。將離心柱放到一個新的1.5 mL離心管內。將15 μL EB緩沖溶液（洗脫緩沖液）直接加到離心柱的膜中心。15 000g 離心1 min洗脫DNA，純化后的DNA儲存在-20 ℃。

1.5.4 PCR 擴增

通過甲基化引物設計軟件MethPrimer 預測gacS基因序列的CpG島位置與位點，并在非CpG位點區設計3 對特異性引物，進而將兩菌株的gacS 分成3 個DNA片段，片段長度依次分別為342 bp、294 bp和354 bp，引物序列見表1，分別取上游、下游引物（10 μmol/L）各1 μL、10*Taq Buffer（3 μL）、Taq 酶（1 μL）、dNTP（1 μL）、模板（2 μL），并加入21 μL 的ddH2O補齊30 μL 體系。根據表3 所示的PCR 反應程序分別對3 個對應片段進行PCR 擴增。擴增產物按照試劑盒中的HiPure Gel Pure Micro Kit（Magen，D2110）產品說明操作，將目標片段割膠純化。

表3 PCR程序

1.5.5 T/A克隆與測序

（1）連接T 載體。采用pTG19-T（Generay，GV6021）作為載體，將上述純化后的PCR 產物與pTG19-T載體連接。首先離心載體及control insert，之后按照表4 的體系配置混勻體系，充分離心，在22 ℃連接1 h。

表4 pTG19-T載體連接反應體系 μL

（2）轉化和挑取質粒送測序。采用感受態細胞（Generay，DL1010）將T載體連接產物進行轉化、復蘇和涂板。通過藍白斑篩選，挑取白斑進行驗證，篩選出轉化成功的陽性克隆。通過基因測序確保重組質粒成功克隆。將含有重組質粒的陽性菌落挑至LB 液體培養基中過夜培養。按照HiPure Plasmid Maxi Kit（Magen，P1004）說明書提取重組質粒，置于-20 ℃儲藏。同時，用60%甘油保種TOPO10 陽性克隆菌株以備后續使用。鑒定轉化成功的陽性質粒，挑取同一樣品的10 個克隆為一組平行完成測序。Sanger 測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.5.6 測序結果分析

將測序產生的原始讀序列進行生物信息技術處理［17］：刪掉原始讀序列中PHRED≤2 的低質量堿基之后的所有堿基；搜索并刪除讀序列兩端的接頭寡核苷酸；將讀序列中的C 替換為T。為保證甲基化測序的重復性和準確性，HT66 與HT66-FLUO 兩菌株的甲基化測序結果均取決于同一樣品的10 個克隆在gacS區域中不同位點的甲基化情況。測序結果經BiQ Analyzer 2.0 軟件進行分析，若gacS 區域位點上測得的胞嘧啶總數量多于根據二項分布模型所估算出的最少胞嘧啶數，即被認定為甲基化位點。而特定CpG位點的甲基化水平指含甲基化胞嘧啶的原始讀序列數量占對應位點上的所有覆蓋讀序列的百分比。

2 實驗結果

2.1 BSP測序質量評估

考慮到短片段DNA甲基化程度的同質性，挑取同一樣品的10 個克隆進行甲基化檢測，特定位點的甲基化比率應是從樣品中分離出的所有DNA 的平均值。取對數生長期的綠針假單胞菌HT66 和HT66-FLUO完成細菌DNA的提取，經NanoDrop-2000 測定其濃度與質量，結果如表5 所示。兩菌株的DNA樣品較為完整，DNA降解和丟失量滿足下游應用的標準。分別對兩菌株的3 個片段進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 擴增產物，結果分別如圖2 所示。將目標片段割膠純化后連接T載體，轉化TOPO10 感受態后選取適量有效陽性克隆提取質粒，并應用ABI3730 平臺進行測序。兩組共20 個樣品測序結果良好，適合下一步數據分析。

表5 HT66 與HT66-FLUO提取DNA樣品的質量檢測

圖2 重亞硫酸鹽修飾后PCR擴增的電泳驗證

2.2 測序結果與分析

測序結果經BiQ Analyzer 2.0 軟件比較并分析后可知，表型突變株HT66-FLUO 中gacS 存在2 個甲基化位點，為便于敘述分別記作CpG1 和CpG2，如圖3、4所示。CpG1 和CpG2 在HT66-FLUO的gacS中甲基化率分別為50%和100%，可明確為高甲基化水平位點，而這兩個位點在出發菌株HT66 的gacS 中的甲基化率均為0。證實了原來的推測，確定了HT66-FLUO 的熒光表型變異是由于gacS中的堿基甲基化引起。

圖3 HT66-FLUO中gacS基因的甲基化CpG位點分布

圖4 HT66-FLUO中gacS甲基化CpG1與CpG2的甲基化頻率

假單胞菌HT66 中gacS 基因全長2 754 bp，甲基化修飾位點CpG1 和CpG2 所在位置分別是gacS編碼區末端的第2 421 位和第2 442 位堿基，并分別對應第807 位組氨酸和第814 位組氨酸。通過對組氨酸激酶gacS的蛋白結構域觀察（見圖5），可以看出兩個甲基化位點所對應的組氨酸位置與HPT（組氨酸磷酸轉移結構域）鄰近，位于REC（磷酸化同源受體結構域）和HPT之間。在假單胞菌的GacA/S雙組分調控中，gacS 屬于跨膜錨定蛋白，具有三重組氨酸傳感激酶，當接受特定的外界信號或環境因子刺激后，通過一種未知的磷酸化機制激活下游應答蛋白GacA，進而實現對下游相關基因的表達［18］。鑒于此我們推測，gacS的甲基化通過影響甲基化位點臨近的HPT 結構域間接阻礙了gacS磷酸基團向GacA 的轉移過程，進而影響GacA蛋白的調控功能。

圖5 gacS蛋白激酶結構域示意圖

3 結語

細菌常通過自發的表型突變來應對復雜多變的生存環境，表觀遺傳可以使同一菌株的基因組在核苷酸序列無變化的前提下發生相關功能的改變［19］。細菌中DNA甲基轉移酶調控基因表達的方式繁多，機制復雜，目前假單胞菌中的表觀遺傳現象報道并不多見。DNA甲基化作為一類重要且廣泛的表觀調節方式［20］，其在假單胞菌中的發現、檢測和進一步研究具有重要的科研價值。

對于甲基化測序方法的選擇，綜合文獻報道、待測序基因結構和實驗成本等多方面因素考慮，本研究選擇了分辨率達到單堿基水平的重亞硫酸鹽測序（BSP）技術。該測序技術靈敏度高，耗時短，實驗成本相對較低。通過BSP技術對綠針假單胞菌HT66 及其表型突變株HT66-FLUO的同一基因片段gacS 并行測定，發現了HT66-FLUO的gacS 中存在2 個甲基化位點，為后續假單胞菌DNA甲基化機制研究提供了實驗基礎。表明BSP檢測方法可應用于細菌單基因的甲基化位點分析。