熒光納米粒子在小鼠胃癌皮下瘤模型近紅外成像中的實驗研究

邵軍?鄭曉明?劉瓊?朱凝?趙靈智?魏波

【摘要】目的 合成特異性靶向胃癌納米粒子，借助自主搭建的近紅外熒光腹腔鏡，探討該納米粒子在胃癌精確診斷及完整切除中的價值。方法 將吲哚菁綠（ICG）通過自主裝方式包覆于雙親性聚合物二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來酰亞胺（DSPE-PEG-Mal），同時，用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽修飾，制備靶向納米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG。通過核磁譜圖驗證產物，吸收光譜檢測光學性質。建立小鼠胃癌皮下瘤模型，在自主搭建的近紅外熒光腹腔鏡下檢測及切除腫瘤。結果 核磁譜圖驗證產物與預期相符，并表現出與游離ICG相似的吸收光譜。在體內實驗中，DSPE-PEG-RGD@ICG可特異性靶向胃癌，指導胃癌的完整切除。靜脈給藥4 h后，熒光腹腔鏡可清楚顯示腫瘤位置。小鼠胃癌皮下瘤檢出率為91.8%，檢出腫瘤的最小直徑為4.9 mm。結論 成功制備了特異性靶向胃癌的納米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG，其光學特性與ICG相似，在近紅外熒光腹腔鏡引導下，可有效地協助外科醫師對小鼠胃癌皮下瘤進行定位及完整切除。

【關鍵詞】近紅外熒光腹腔鏡;熒光納米粒子;吲哚菁綠;胃癌

Experimental study of near-infrared imaging of fluorescent nanoparticles in gastric cancer mouse models with subcutaneous tumors Shao Jun， Zheng Xiaoming， Liu Qiong， Zhu Ning， Zhao Lingzhi， Wei Bo. Department of Gastrointestinal Surgery， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Wei Bo， E-mail： weibo3@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To synthesize a gastric cancer-specific nanoparticle and to explore the value of the nanoparticle in accurate diagnosis and complete resection of gastric cancer under the guidance of self-built near-infrared fluorescence laparoscopy. Methods Indocyanine green （ICG） was encapsulated into the amphiphilic polymer distearyl phosphatidylethanolamine-polyethylene glycol-Maleimide （DSPE-PEG-Mal） by self-assembly method. And the surface of the polymer was modified with arginine-glycine-aspartic acid polypeptide （RGD） to prepare targeted nanoparticles DSPE-PEG-RGD@ICG. The product was verified by NMR and the optical properties were detected by absorption spectrum. The gastric cancer mouse models with subcutaneous tumors were established， and the tumors were detected and resected under self-built near infrared fluorescence laparoscopy. Results The NMR spectra showed that the product was consistent with the expected product and showed a similar absorption spectra to free ICG. In in vivo experiment， DSPE-PEG-RGD@ICG could specifically target gastric cancer and guide the complete resection of tumors. At 4 h after intravenous administration， the location of tumors could be clearly displayed by fluorescence laparoscopy. The detection rate of subcutaneous tumors in gastric cancer mouse models was 91.8%， and the minimum diameter of detected tumors was 4.9 mm. Conclusions The successfully prepared nanoparticles targeting gastric cancer have optical properties similar to that of ICG， which can effectively assist surgeons in the complete resection of subcutaneous tumors in gastric cancer mice under the guidance of self-built fluorescence endoscopy system.

【Key words】Near-infrared laparoscopy;Fluorescent nanoparticle;Indocyanine green;Gastric cancer

胃癌是全球常見的惡性腫瘤，其癌癥相關死亡率在所有癌癥中居第二位，嚴重威脅著人類的健康和生活質量[1]。目前，腹腔鏡胃切除術已被廣泛接受為治療胃癌的一種微創手術[2]。對于早期胃癌，內鏡手術，如內鏡黏膜切除術（EMR）和內鏡黏膜下剝離術（ESD），也被越來越多的應用于臨床[3-4]。盡管如此，無典型體征或輕度典型體征給早期胃癌的診斷帶來很大困難，大多數胃癌患者初診時已經是中晚期。早期胃癌的5年生存率可達到90%，而中晚期胃癌患者的5年生存率約為10% ～ 30%[5-6]。此外，由于缺乏直接觸覺感受，外科醫師對腹腔鏡手術中的腫瘤精確定位及判斷也存在一定的難度。因此，如何提高胃癌的早期診斷及精準完整的切除是胃癌診療過程中亟需解決的關鍵問題。近年來，吲哚菁綠（ICG）引導下的近紅外成像技術逐漸應用于腹腔鏡胃癌根治手術，但由于游離ICG存在缺乏腫瘤靶向特異性，不穩定，容易淬滅等缺陷，目前ICG并未廣泛應用于臨床[7-8]。

本研究通過雙親性聚合物二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-馬來酰亞胺（DSPE-PEG-Mal）包覆ICG，形成水溶性熒光納米粒子。并用能與整合素αvβ3特異性結合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）多肽進行修飾，合成具有腫瘤特異性的靶向熒光納米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG，用以胃癌可視化成像及精準切除。本研究使用自主搭建的近紅外熒光腹腔鏡，在小鼠的胃癌皮下瘤模型中驗證了該熒光納米粒子的胃癌靶向性，為臨床上客觀指導外科醫師早期及精準切除胃癌提供了一個新的策略。

材料與方法

一、實驗材料

胃癌SGC7901細胞株購買于廣州貝奧吉因生物技術有限公司。DSPE-PEG-Mal（Kw = 2000）購于上海炎怡生物科技有限公司。ICG購于上海融禾醫藥科技發展有限公司，RGD多肽購于上海吉爾生化有限公司。雌性BALB/c裸鼠（3 ～ 5周）購于北京維頓利華實驗動物科技有限公司。

二、納米材料的合成與表征

通過自組裝方式將ICG包覆于納米粒子中，通過邁克爾加成反應將RGD連接于表面，形成具有靶向功能的熒光納米粒子，命名為DSPE-PEG-RGD@ICG。

具體合成過程如下：分別稱取20 mg DSPE-PEG-Mal凍干粉和6.7 mg ICG，將兩者混合溶于3 ml四氫呋喃，超聲混合充分，再在超聲探頭的超聲環境中，將混合溶液逐滴加入20 ml純水，超聲30 min，轉移至3500 Da透析袋，透析24 h去除雜質，凍干保存。稱取20 mg制備的凍干粉，溶于5 ml純水，加入6 mg RGD多肽，攪拌反應4 h后，用1000 Da透析袋24 h，凍干保存備用，即得到具有靶向性的DSPE-PEG-RGD@ICG熒光納米粒子。通過核磁譜圖驗證產物的合成。然后取適量的樣品均勻分散在超純水中，配制成ICG濃度為10 μg/ml的溶液，在室溫條件下用紫外-可見光分光光度儀進行測定，記錄500 ～ 900 nm范圍內的光譜。

三、近紅外熒光腹腔鏡的搭建

采用785 nm光纖耦合激光器（MW-GX- 785/1500 mW，長春飛秒科技有限公司，中國）作為激發光光源，可見光光源使用醫用LED冷光源（AGS100，梧州奧格森科技有限公司，中國）。內窺鏡（11.0031a，Scholly Fiberoptic GMBH，德國），直徑10 mm，工作長度344 mm，0°視角?；诜止饫忡R的雙圖像傳感器集成工業相機（BV-C8820CL，Bluevision Ltd，日本）實現可見光與近紅外熒光的同時成像。選用智能圖像采集卡（microEnable-5-Marathon-ACL，Silicon Software，德國），通過E-Vision CL線纜與集成相機的數據接口相連接，能高速傳輸到計算機。并自主開發了一款適用于該成像系統的軟件，運行環境為Windows 10操作系統，將圖像采集卡采集到的原始數據經過計算機軟件處理后經顯示器顯示。

四、裸鼠胃癌皮下瘤模型的建立及熒光可視化成像

用3 ～ 5周齡雌性BALB/c裸鼠及胃癌細胞株SGC7901建立胃癌皮下瘤模型。將含有5×106個SGC7901細胞的磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液（0.2 ml）注射到裸鼠腋下，每隔1 d測量1次腫瘤大小，并計算體積：體積=長軸×短軸2/2。當腫瘤體積達到150 mm3左右時進行體內實驗。選擇9只荷瘤小鼠隨機分成3組，每組各3只，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，分別尾靜脈注射0.2 ml ICG、DSPE-PEG@ICG和DSPE-PEG-RGD@ICG溶液（每只小鼠ICG當量為2 mg/kg）。在特定的時間間隔（0.5、1、2、4、6 h）用自主搭建的熒光腹腔鏡對小鼠進行熒光可視化成像，觀察并記錄不同藥物在小鼠體內的分布情況。

五、近紅外熒光成像指導下的精準手術

選擇50只小鼠，皮下瘤模型建立9 d后（腫瘤直徑為4 ～ 5 mm）進行實驗。于術前4 h經尾靜脈注射DSPE-PEG-RGD@ICG納米粒子（劑量與前保持一致）。隨后麻醉小鼠并在熒光腹腔鏡引導下進行腫瘤切除。手術期間，通過實時白光/NIR熒光切換將腫瘤部位可見的熒光組織全部切除，記錄腫瘤大小，并將切下的組織送病理檢查。

結果

一、DSPE-PEG-RGD@ICG的合成及光譜

DSPE-PEG-RGD@ICG的合成方式如圖1A所示，首先利用自組裝方式將ICG包覆于DSPE-PEG-Mal中，然后利用邁克爾加成反應將RGD多肽連接于納米粒子表面，動態光散射法測得產物粒徑為（147.6±3.9）nm。DSPE-PEG-RGD核磁譜圖如圖1B所示，在7.43 ppm及6.47 ppm處出現新的吸收峰，這兩處為RGD分子結構中苯環上氫的吸收峰，可判斷RGD成功接在DSPE-PEG-Mal上，證實RGD成功修飾于納米粒子表面。DSPE-PEG-RGD@ICG和ICG的吸收光譜如圖1C所示，與游離ICG表現出類似的光學特性，表明DSPE-PEG-RGD@ICG未改變ICG的熒光性質。

二、近紅外熒光腹腔鏡的搭建及測試

熒光腹腔鏡內部結構原理圖及實物圖見已發表文獻[9]。激光照射后，不同濃度ICG水溶液發射出不同強度的熒光信號。該成像系統能敏感捕捉到ICG濃度變化帶來的光學信號的改變，表明該近紅外成像系統搭建成功，見圖2。

三、荷瘤小鼠熒光可視化成像

通過構建裸鼠胃癌SGC7901皮下瘤模型，觀察納米粒子的體內生物分布情況。尾靜脈注射不同熒光藥物后，在多個時間點采集各組小鼠的熒光信號，見圖3。3組靜脈給藥后，熒光信號迅速分布全身，主要集中于肝臟。隨著時間的延續，3組熒光藥物逐漸被肝臟代謝，熒光信號相應減弱。2 h后，游離ICG組僅在肝臟和腫瘤區域殘留微弱的熒光信號，而DSPE-PEG@ICG和DSPE-PEG-RGD@ICG組在腫瘤部位仍有較高的熒光積累。

4 h后，肉眼下，游離ICG組腫瘤部位基本觀察不到綠色熒光，DSPE-PEG-RGD@ICG組在腫瘤部位的綠色熒光清晰可見，與非靶向納米粒子DSPE-PEG@ICG組相比，能較好地顯示出腫瘤輪廓。6 h后，切開皮膚，解剖腫瘤，在熒光腹腔鏡輔助下，DSPE-PEG-RGD@ICG組腫瘤組織與正常組織可以較好地區分開來。與游離ICG相比，DSPE-PEG-RGD@ICG在體內具有更好的胃癌靶向能力。同時，最佳的手術操作時間是在靜脈給藥4 h后，此時，腫瘤部位熒光信號較強，其余部位如肝臟殘留的熒光信號的影響較小。

四、熒光腹腔鏡輔助下的胃癌小鼠模型的腫瘤切除

根據活體成像結果，經尾靜脈注射DSPE-PEG-RGD@ICG 4 h后，利用熒光腹腔鏡切除腫瘤，見圖4A。構建50只小鼠胃癌皮下瘤模型，造模9 d后，皮下腫塊平均直徑為5.49 mm，見圖4B。調整好參數后，將視野內可見的綠色熒光信號組織全部切除，同時送病理分析，證實是否為癌組織，見圖4C。對于熒光下未顯影的可疑腫塊一并切除送檢。1只小鼠皮下瘤模型病理下未見癌細胞，考慮為炎性組織，同時未能檢測到熒光信號;4只小鼠腫瘤熒光下未顯影（直徑分別為3.1、3.2、3.5和4.0 mm），考慮瘤塊較小，熒光信號較弱，未能檢測出來;45只小鼠皮下瘤熒光下顯影，最終證實為癌組織，因此，納米粒子對構建的胃癌模型檢出率為91.8%。

討論

既往研究表明，胃癌的治療效果與腫瘤分期及完整切除密切相關。目前，腹腔鏡胃癌根治術以其手術創傷小，術后恢復快等獨特優勢廣泛應用于臨床，但仍存在一些弊端。對于早期胃癌，腫瘤位于黏膜或者黏膜下層，常常需要進行術前定位或者術中聯合胃鏡來對腫瘤位置進行定位。術前胃鏡下留置金屬夾標記腫瘤位置存在夾子脫落導致定位失敗的風險;術中胃鏡則需要專門的內鏡醫師進行操作，并且延長手術時間[10]。對于進展期胃癌，由于缺乏直接觸覺感受以及開放手術的直接肉眼觀察，導致微小轉移灶不易被發現和切除。近年來，熒光成像技術在臨床中的應用越來越受到學者們的關注，試圖通過熒光分子來實現腫瘤的特異性顯像，達到精準診療的目的。其中，納米載體是最常用的技術手段。

納米載體的發展是為了應對藥物輸送的需要，這些方法解決了藥物溶解度低、非特異性細胞毒性、次優藥物動力學和藥效動力學，以及較低的生物藥效率的問題[11-12]。藥物輸送系統的設計是為了適應癌癥的“主動靶向”和“被動靶向”。被動靶向是藥物輸送系統可以通過增強腫瘤脈管系統開窗進入腫瘤，并利用實體瘤中觀察到的增強通透性和保留（EPR）的一種手段。由于腫瘤血管滲漏和腫瘤淋巴引流不良，EPR效應允許腫瘤選擇性的攝取和保留納米顆粒。此外，聚合物的多種功能為進一步改性提供可能，通過特異性配體修飾納米顆粒的表面來實現主動靶向。整合素在多種腫瘤細胞表面和腫瘤血管內皮細胞表面高表達，而在正常細胞和血管內細胞中低表達，在癌細胞的增殖、遷移和侵襲中發揮重要作用[13]。有研究表明，整合素αvβ3在胃癌中廣泛表達，并可能有助于胃癌亞型的常規分類[14]。本研究使用高表達整合素αvβ3的胃癌細胞SGC7901，建立胃癌皮下瘤模型。RGD多肽能夠與整合素特異性結合，是目前研究最多的腫瘤精確診斷和治療靶向分子之一。本研究選用RGD多肽修飾納米粒子表面，通過納米粒子的被動靶向，以及RGD多肽的主動靶向，實現對胃癌細胞的靶向結合。該載藥系統并未改變ICG本身的光學特性。

既往研究表明，當ICG濃度大于80 μg/ml時，由于形成二聚體和多聚體，熒光強度反而隨濃度的增加而下降[15]。本研究中該成像系統同樣觀察到了類似的現象，表明該系統搭建成功?；铙w成像結果表明，與游離ICG和非靶向納米粒子DSPE-PEG@ICG相比，DSPE-PEG-RGD@ICG表現出更好的腫瘤靶向富集。靜脈給藥4 h后，在該熒光腹腔鏡輔助下，腫瘤部位的熒光信號高于周圍的正常組織。為進一步驗證該納米粒子對微小腫瘤的檢出率，我們對50只荷瘤小鼠進行手術。結果表明該系統對胃癌皮下瘤檢出率為91.8%，檢出腫瘤的最小直徑為4.9 mm。此外，該系統能夠實時監測腫瘤切除情況，對于術中殘留的少量熒光組織，切除后病理確診為腫瘤組織。既往研究表明，對于進展期胃癌出現腹膜轉移的患者，術前輔助檢查如腹部超聲、CT和PET等很難發現小于5 mm的腫瘤結節，往往需要腹腔鏡檢查或脫落細胞學檢查[16]。本研究結果提示在該成像系統輔助下，DSPE-PEG-RGD@ICG在胃癌的精準診斷及完整切除方面具有很大的臨床應用潛力。

綜上所述，為了實現胃癌的可視化成像及精準切除，本研究構建了一種RGD多肽修飾的熒光納米粒子DSPE-PEG-RGD@ICG。核磁譜圖證實產物的成功合成，吸收光譜顯示出與游離ICG相似的光學特性。借助自主搭建的熒光腹腔鏡，證實了該納米粒子在胃癌皮下瘤小鼠腫瘤部位的靶向富集，通過對荷瘤小鼠進行熒光成像輔助下的腫瘤切除，表明該系統對胃癌檢出率為91.8%。目前，ICG近紅外成像技術在胃癌診療中的應用尚處于探索階段，我們的研究結果為胃癌的精準診斷及治療提供了一個新的策略。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-11-10）

（本文編輯：楊江瑜）