亞甲藍影響異氟烷對老年阿茨海默病小鼠神經毒性的研究

周裕凱，余 茹，張先杰，夏樂強

隨著找國人口老齡化，全身麻醉藥物對老年患者神經毒性的研究成為麻醉學領域的熱點，但因缺乏血液特異性標志物，且受倫理限制無法獲得人大腦切片，該類研究多集中在基礎領域。

異氟烷（isoflurane，Iso）作為吸入麻醉藥，能通過影響淀粉樣β(amyloid-β，Aβ)蛋白在細胞外累積和異常表達的磷酸化Tau（phosphorylated tau,p-Tau）蛋白在細胞內形成，加速老年常見神經退行性疾病——阿茨海默?。ˋlzheimer's disease,AD）的病理過程[1-2]。鋰鹽、黃芪甲苷和甘草酸苷等均被證實能在動物模型中減輕異氟烷神經毒性，起到保護作用[3-5]。

亞甲藍（methylene blue，MB）是一種陽離子噻嗪類染色劑，最早在上世紀90年代，被發現能減緩AD病理過程[6]，其衍生合成的新藥能治療輕、中度AD[7]。亞甲藍還能通過NO-鳥苷酸環化酶信號通路和異氟烷產生交互影響[8]，但其能否減輕異氟烷神經毒性，目前尚缺乏相關報道。

本研究通過老年AD小鼠模型，觀察了行為學表現和蛋白表達，旨在探討亞甲藍對異氟烷神經毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用南京生物醫藥研究院提供的12月齡雄性C57BL/6野生型小鼠(WT鼠)和C57BL/6 AD轉基因APP695小鼠（APP鼠），生產許可證為[SCXK（蘇）2015-0001]。飼養于重慶威斯騰生物醫藥科技有限責任公司SPF級動物房，使用許可證為[SYXK（渝）2019-0002]。保持動物房12～12 h晝夜交替，溫度23～25℃，自由飲水、進食，適應性喂養1 w后進行實驗。本研究通過德陽市人民醫院倫理委員會審查，審查號：2020-04-180。

1.2 分組及處理方法 WT鼠和APP鼠共分為4組。WTMB組和APPMB組：經尾靜脈注入2 mg/kg亞甲藍（濟川藥業集團有限公司，批號為1406012）15 min后，放入有機玻璃盒子(5 cm×5 cm×15cm)吸入100%氧氣（1 L/min）；APPMB+Iso組：注入2 mg/kg亞甲藍后吸入1 U最低肺泡濃度（minimum alveolar concentration，MAC）異氟烷（山東魯南貝特制藥有限公司，批號為64140302），氧流量為1 L/min；APPIso組：注射同體積生理鹽水后吸入1 U MAC異氟烷。吸入氧氣或異氟烷都為4 h，保持小鼠直腸溫度在36～38℃。

MAC是指吸入麻醉藥在一個大氣壓下與純氧同時吸入時，能使50%患者在切皮時不發生反應時的最低肺泡濃度，是不同吸入麻醉藥的等效價濃度。為排除亞甲藍對異氟烷MAC的影響[9]，根據Li等[10]報道的方法進行預實驗，測得APPMB+Iso組和APPIso組異氟烷的1 MAC均為1.4%。

1.3 Morris水迷宮實驗 每組5只小鼠，共20只。采用直徑1.2 m，高0.6 m，水深0.4 m的圓形水池（安徽正華生物儀器設備公司），水溫為20～22℃，直徑0.2 m的逃生平臺設在水池西北角，淹沒于水下1 cm。定位航行實驗：經處理后的第1 d，小鼠被訓練從水池4個不同象限邊界出發尋找逃生平臺，每只小鼠4次，如超過60 s，將人為引導到平臺并逗留20 s，連續4 d，每次持續60 s，每次間隔5 min，評估小鼠學習能力?？臻g探索實驗：每天最后一次訓練后，將小鼠放入移去平臺的水池中，每只小鼠仍從4個不同象限起點出發尋找原平臺位置，共4次，以評估記憶能力。攝像系統記錄60 s內潛伏時間、速度和穿臺次數等行為學數據。

1.4 蛋白印跡實驗 每組9只小鼠，共36只。經處理后第1、3、7 d，每組分別取3只處死，提取海馬組織萃取蛋白，經10%SDS凝膠電泳（美國Amresco公司）分離轉膜，采用含5%脫脂牛奶和0.1%聚山梨酸酯的緩沖鹽水（pH7.6）封膜2 h，4℃下與抗體孵化過夜?？贵w（美國Abcam公司）包括：多克隆兔p-Tau抗體（1∶500）、多克隆兔Aβ1～42抗體（1∶500）、多克隆兔β-actin（1∶1000）。第2 d，用辣根過氧化物酶復合物（美國Sigma公司）作第二抗體在室溫下孵化1.5 h,采用凝膠成像系統（美國Wealtec公司）分析印跡條帶積分吸光度。以β-actin為內參蛋白，目的蛋白吸光度與內參蛋白吸光度比值表示目的蛋白表達水平。

1.5 統計學方法 應用SPSS22.0軟件分析，計量資料以±s表示。Morris水迷宮實驗用重復測量方差分析，組間多重比較采用Games-Howell法；蛋白印跡實驗用單因素方差分析，組間多重比較采用Games-Howell法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 學習與記憶能力比較 定位航行實驗中，WTMB組學習能力最佳，隨訓練時間延長，潛伏時間降低最明顯，與其余3組有統計學差異（P＜0.05）；APPIso組學習能力最差，潛伏時間曲線最平緩，較其余組有統計學差異（P＜0.05）；APPMB+Iso組潛伏時間改善幅度明顯差于APPMB組（P＜0.05）。見圖1A。

所有組在空間探索實驗的運動能力未受影響，平均速度無明顯差別（P＞0.05），見圖1B。WTMB組記憶能力最好，表現為穿臺次數明顯多于其余3組（P＜0.05）；APPIso組記憶能力最差，穿臺次數明顯少于其余組（P＜0.05）；APPMB組和APPMB+Iso組穿臺次數無明顯差異（P＞0.05），見圖1C和圖2。

圖1 Morris水迷宮實驗中學習與記憶能力的比較

圖2 Morris水迷宮空間探索實驗小鼠運動軌跡

2.2 Aβ1～42蛋白和p-Tau蛋白比較 WTMB組Aβ1～42蛋白和p-Tau蛋白水平平穩，組內變化隨時間延長，無統計學差異（P＞0.05）；APPMB組蛋白隨時間延長明顯增加（P＜0.05）；APPMB+Iso組和APPIso組蛋白水平第1 d達到頂峰，后隨時間延長明顯明顯下降（P＜0.05）。見圖3和表1。

第1、3 d蛋白水平，4組間有明顯差別（P＜0.05），WTMB組最低，APPIso組最高，APPMB組明顯低于APPMB+Iso組（P＜0.05）。第7 d時，APPMB組、APPMB+Iso組和APPIso組間的Aβ1～42蛋白差異無統計學意義（P＞0.05）；APPMB組和APPMB+Iso組間的p-Tau蛋白差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

3 討論

為節約研發時間和成本，現代藥學傾向于拓寬已批準藥物的適應證。近期發現，靜脈注射地塞米松也能減輕異氟烷對新生野生大鼠的神經毒性，改善受損神經細胞結構[11]。本研究選用了易透過血腦屏障的亞甲藍，它被發現能減輕AD、缺血性腦卒中、外傷性腦損傷等神經學損害[12-14]。

圖3 蛋白印跡實驗Aβ1～42蛋白和p-Tau蛋白表達電泳圖

首先，為排除因小鼠性別不同造成神經損傷程度的差異[15]，本研究只選用雄性小鼠。靜脈注射0.5～4 mg/kg亞甲藍能緩解AD進程[16-17]，但其劑量>5 mg/kg可能會降低異氟烷MAC[9]，為排除這一干擾因素，本研究先行預實驗發現2 mg/kg亞甲藍不影響異氟烷MAC，APPMB+Iso組和APPIso組1 U MAC均為1.4%，與Li等[10]報道的同種小鼠異氟烷MAC相同。

定位航行實驗中（圖1A），4組潛伏時間有統計學差異（P＜0.05），說明異氟烷損傷老年AD小鼠學習能力，亞甲藍能減輕該損傷，發揮神經保護作用?？臻g探索實驗中，異氟烷和亞甲藍均不影響小鼠運動能力；APPMB組和APPMB+Iso組穿臺次數無明顯差異（P＞0.05），APPIso組穿臺次數明顯少于其余組（P＜0.05）（圖1C和圖2），說明異氟烷對AD小鼠記憶無負面影響，亞甲藍能改善AD小鼠記憶。Chen等[18]也發現亞甲藍能改善AD大鼠學習和記憶能力，海馬體注入含36 g亞甲藍納米復合體后，潛伏時間明顯改善（P＜0.05），目標象限停留時間明顯延長（P＜0.05）且不影響運動能力（P＞0.05）。異氟烷對AD小鼠模型行為學的影響尚有爭議，Joseph等[19]發現14～16月齡AD小鼠連續5 d吸入1.1%異氟烷2 h，學習能力受損嚴重（P＜0.05），記憶能力無顯著影響（P＞0.05）；趙燕星等[20]則發現7月齡AD雙轉基因APPswe/PS1dE9小鼠連續5 d吸入1.1%異氟烷2 h后，學習、記憶能力反而有一定提高（P＜0.05）。這可能與動物種類、月齡、測試方法等不同有關，其中機理需進一步探索和研究[19]。

蛋白水平的影響比行為學持久，故選擇經處理后第1、3、7 d進行檢測，結果提示異氟烷的神經損傷也體現在蛋白水平，而亞甲藍不光能減輕異氟烷的損傷，還能降低APPMB組蛋白水平，改善AD病程（圖3和表1）。第7 d時，3組APP鼠間的Aβ1～42蛋白，APPMB組和APPMB+Iso組的p-Tau蛋白已無統計學差異（P＞0.05），說明吸入1.4%異氟烷4 h對AD小鼠神經損傷是可逆的，單次靜脈注射2 mg/kg亞甲藍在蛋白水平的保護作用也不持久。

亞甲藍減輕異氟烷神經毒性，產生保護作用的機理，推測與線粒體有關。線粒體功能失調是異氟烷介導神經損傷的重要靶點，包括改變線粒體形態、降低膜電位、破壞電子傳遞鏈復合體Ⅳ和增加活性氧簇，從而觸發半胱天冬酶途徑的細胞凋亡[21-22]。線粒體也是亞甲藍治療AD的關鍵節點，亞甲藍可通過增加復合體Ⅳ活性，促進線粒體轉運，抑制淀粉樣復合乙醇脫氫酶和減少氧化應激標志物，從而降低Aβ蛋白和p-Tau蛋白水平，抑制Aβ寡聚物和Tau蛋白纖維形成[23]。

表1 小鼠海馬組織中蛋白和p-Tau蛋白表達水平(?，n=9)

表1 小鼠海馬組織中蛋白和p-Tau蛋白表達水平(?，n=9)

注：與同天WTMB組比較，①P＜0.05；與同天APPMB組比較，②P＜0.05；與 同天組比較，③P＜0.05；與組內第1 d比較，④P＜0.05

Aβ/β-actin 組別 第1 d 第3 d 第7 d WT 0.2482±0.0146 0.2504±0.0079 0.2530±0.0141 APP 0.6438±0.0380 0.6937±0.0139 0.7500±0.0452 APP 1.4857±0.0271 1.5921±0.0502 1.0781±0.1048 p-Tau/β-actin 組別 第1 d 第3 d 第7 d WT 0.1504±0.0021 0.1557±0.0072 0.1518±0.0078 APP 0.2908±0.0030 0.3220±0.0090 0.3927±0.0062 APP 0.8037±0.0369 0.5627±0.0446 0.4060±0.0098 APP 1.1306±0.0713 0.8224±0.0177 0.6046±0.0084

綜上所述，靜脈注射2 mg/kg亞甲藍能減輕異氟烷對老年AD小鼠的神經毒性，但其機制尚需進一步研究。麻醉藥物神經毒性的研究需要拓寬思路，發現更多有潛在保護機制的藥物，以期待未來能用于臨床中。