大麗輪枝菌致病機理及相關致病基因研究進展

金利容 黃薇 楊妮娜 尹海辰 萬鵬

摘要 大麗輪枝菌是農作物上為害最嚴重的土傳病原物之一，對于該病原物引起的病害目前仍缺乏有效的防控手段，而明確其致病機理被認為是開發新型藥劑和防治技術的理論基礎。綜述了大麗輪枝菌的侵染過程、植物細胞壁的降解、微菌核和黑色素的形成等一些重要的生理過程相關的致病基因，并總結了轉錄調控基因、毒力蛋白基因、效應因子、無毒基因和激發子等多方面致病相關基因的研究結果，最后概述了篩選致病基因和研究基因功能的方法。

關鍵詞 大麗輪枝菌;致病機理;致病基因

中圖分類號 S435.621.2? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）10-0015-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.005

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress on the Pathogenesis and Pathogenic Related Genes of Verticillium dahliae

JIN Li-rong， HUANG Wei， YANG Ni-na et al

（Key Laboratory of? Integrated Management of Crop Pests in Central China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Plant Protection， Soil and Fertilizer， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei? 430064）

Abstract Verticillium dahliae was one of the most destructive soil-borne pathogens in crop plants. There was no effective method to control the diseases caused by V. dahliae. The studies on its pathogenic mechanism were thought as the theoretical basis to develop new pesticides and? control techniques. This article reviewed some pathogenic genes related with some important physiological processes such as the process of infection， the degradation of plant cell walls and the formation of microsclerotia and melanin. The research results of multiple pathogenic genes such as transcriptional regulatory genes， virulence protein genes， effector genes， avirulence genes and elicitors were summarized. The strategies of screening the pathogenic genes and researching the functions of the genes were summarized.

Key words Verticillium dahliae;Pathogenesis;Pathogenic genes

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）隸屬半知菌類絲孢綱絲孢目叢梗孢科輪枝菌屬。大麗輪枝菌是一種通過土壤傳播的植物病原真菌，病原菌能夠定殖在植物維管束內，引起植物的萎蔫癥狀。大麗輪枝菌在世界范圍內均有分布，且寄主范圍廣泛，可侵染660多種植物，包括經濟作物（如棉花、茄子、番茄、西瓜等）及糧食作物（如馬鈴薯等），對農作物的生產可造成嚴重的經濟損失。大麗輪枝菌侵染寄主后會引起萎蔫癥狀，俗稱黃萎病。大麗輪枝菌引起的病害較難控制的一個重要原因在于其能夠形成微菌核的休眠結構，微菌核可以在土壤中長期存活，且其抵御外界逆境的能力強。因此，科學家試圖通過研究病原菌致病的分子機制和信號通路，尋找病害防治的新策略。隨著研究的不斷深入，近幾年大量文獻報道了大麗輪枝菌致病的相關基因，試圖闡述其致病的分子機理。隨著高通量測序技術的發展，2008年美國Broad研究所完成了從萵苣中分離出來的大麗輪枝菌VdLs.17菌株的全基因組測序工作，整個基因組大小為33.8 Mb，編碼10 535個蛋白。測序工作為致病相關基因的研究提供了更好的平臺。

筆者對國內外關于大麗輪枝菌的致病機理及相關致病基因的研究進行了綜述，以期為更好地防治此類病害提供理論依據。

1 大麗輪枝菌的致病基因

1.1 大麗輪枝菌侵染過程相關的致病基因

研究者們利用熒光蛋白標記技術對大麗輪枝菌菌株進行標記，并觀察和記

錄大麗輪枝菌對寄主植物的侵染過程。以棉花和擬南芥為研究對象，當大麗輪枝菌接種到寄主植物的根部，2～ 6 h后分生孢子吸附在根的表面，并隨機分布在寄主的主根或側根;12 h后，部分分生孢子萌發，形成芽管和菌絲;2 d后，大量菌絲包裹在根部表面并進入根部組織，在根部組織內縱向和橫向擴展;5 d后，菌絲在縱向延伸時快速增殖，同時菌絲向維管組織中擴展，并在木質部中形成一個菌絲網[1]。10 d后，菌絲沿木質部導管向上延伸到地上組織，并到達側枝部分;12 d后，菌絲向根尖區域延伸，導致根冠塌陷;14 d后，根部菌絲減少，地上部分開始出現萎蔫癥狀[2]。

整個侵染過程涉及復雜的分子調控機制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會形成附著枝和侵染釘。其中，2個基因VdNoxB和VdPls1被證實在侵染釘的形成過程發揮重要作用，VdNoxB編碼一個膜結合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個四跨膜蛋白，它們形成復合物，共同定位于附著枝基部。復合物VdNoxB/VdPls1通過介導活性氧的產生來提高細胞內的鈣離子含量，進而激活轉錄因子Crz1介導的信號途徑，最終促進侵染釘的形成[3]。當2個基因分別缺失時，侵染釘便不能形成，導致菌株的致病力下降。侵染釘衍生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開，形成一個病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效應蛋白）以及一些信號分子通過囊泡運輸和胞吐作用被輸送到這個侵染界面，形成蛋白環。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉運因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵染界面的傳輸，導致菌株毒力的下降。在菌株對根部的感染過程中，菌絲頸是一個重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過抑制和逃避寄主植物的防御反應，實現對寄主的成功感染[4]。

1.2 細胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細胞壁降解酶（CWDE），細胞壁降解酶通過降解寄主的細胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準備。CWDE可分為果膠酶、角質酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時間內掃除植物體內一些果膠物質的障礙，進而完成在木質部導管內的定殖和擴散，同時不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產生的果膠，其降解產物還可以作為重要的營養物質為病原菌的生長發育提供能量[6]。利用生物信息學預測到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個PL1家族的果膠裂解酶和10個GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關，強致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時，不同果膠酶對病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對致病力并沒有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導細胞死亡和植物的防御反應，2個基因的缺失均能夠導致菌株Vd991在棉花寄主上的毒力顯著降低。內切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內切葡聚糖酶基因VdEg-1對于早期的侵染定殖至關重要，該基因的缺失導致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是一種重要的細胞壁降解酶，研究證實VdSSP1的缺失能夠降低其對果膠和淀粉的利用率以及對棉花的致病力[11]。蔗糖非發酵蛋白激酶VdSNF1（sucrose non-fermenting protein kinase 1，SNF1）是細胞壁水解酶上游的一個負調控基因，主要參與糖類信號和真菌發育信號的傳遞。該基因的缺失導致病原菌對果膠和半乳糖的利用能力受到嚴重影響，且可以引起番茄寄主的致病力下降達到87%，在寄主植物維管束內不能成功定殖[12]。幾丁質酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應和防御反應以及一些信號轉導和抗性相關基因的表達上調[13]。

細胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒有同源關系的基因編碼的多肽，除了包含一些關鍵基因，也包含一些功能重復的基因，多個基因之間相互調控，共同參與了真菌生物學毒性的產生過程，因此在缺失功能上冗余的其中一個基因后并不會產生致病力的變化，但一些關鍵基因的缺失還是會導致毒力的顯著下降或喪失?？傮w而言，細胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過程中發揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結構，微菌核能夠在土壤中存活數10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數根菌絲經分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環境。微菌核是自然界最初的侵染源，當外界自然環境適宜時植物的根系分泌物會誘導微菌核萌發形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關。

絲狀真菌會分泌包含8個半胱氨酸殘基保守結構域（約100個氨基酸）的小分子量蛋白質，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結構的形成和有性生殖等很多方面都發揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環境的能力降低，但致病性并沒有明顯變化。相對于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長期存活有關。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關的一些基因的表達下調，但疏水蛋白基因VDH1的表達并沒有發生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產生受到顯著抑制，產孢能力和生長速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營養環境下，其突變體也能夠形成微菌核，說明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測VdGARP1在微菌核的初始形成階段發揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調節一些黑色素合成相關基因的表達，以增強大麗輪枝菌對紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會影響乙烯合成、黑色素形成和致病性等相關基因的表達，其突變株可以產生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長速度和產孢能力下降，微菌核的產生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個多功能基因，參與了菌絲的生長發育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學功能[20]。

RNA-Seq分析產微菌核菌株和不產微菌核菌株的基因的表達[21]，得到200多個差異表達基因，其中包括參與黑色素合成途徑的一些基因（如聚酮合成酶、THN還原酶、漆酶等），還有一些未知蛋白基因。這說明產微菌核和黑色素的過程是受多基因調控的。

1.4 其他致病基因

1.4.1 轉錄調控基因。

與自然界所有有機體一樣，植物病原菌在侵染植株的過程中也對周圍環境的變化作出相應的應答反應，信號轉導途徑在此過程中起重要作用。真菌經典的信號轉導途徑包括促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、G蛋白介導的信號通路和環腺苷酸（cAMP）信號通路。大麗輪枝菌的致病過程與這些信號通路存在密切的關系[22-23]。信號轉導過程如下：當識別受體結合相應的激發子后結構發生變化，隨后激活一個或多個下游基因，導致下游基因的表達以及有機體的響應。MAPK信號通路調控病原菌的生理過程（如菌絲的定向生長和附著生長、侵染結構的形成、毒素的分泌等）。MAPK信號通路較為保守，包括3種激酶（MAPKKK、MAPKK和MAPK），通過每級的磷酸化將信號傳遞給下游應答分子。cAMP 信號通路與MAPK信號通路協作，調控真菌對環境的適應、真菌的生長發育、毒力蛋白的表達等[24-25]。G蛋白介導的信號通路調控病原菌的細胞壁降解酶、碳代謝、次級代謝物的合成等[26]。在大麗輪枝菌中，MAPK家族基因VMK1的缺失突變體產孢量降低，微菌核的形成減少，同時在萵苣和番茄上的毒力下降[17]。位于MAPK信號通路上游的編跨膜粘蛋白基因Msb的缺失突變后，產孢量和微菌核的形成減少，侵染能力和附著能力也大大降低[27]。cAMP信號通路中，大麗輪枝菌的基因VdPKAC1是編碼cAMP依賴的蛋白激酶 A（cAMP-dependent protein kinase A，PKA）的催化亞基，VdPKAC1的缺失突變體雖然沒有影響大麗輪枝菌的根部侵染能力，但引起了致病力的顯著下降[22]。在G 蛋白介導的信號通路中，大麗輪枝菌的G蛋白β亞基（VGB）缺失突變株的致病力下降，生長表型也會受到影響，微菌核和孢子的產量增加[23]。

真菌轉錄因子（TFs）在許多植物病原菌中被證實具有調控植物病原菌毒力相關基因表達的功能。大麗輪枝菌中含有一個具有真菌轉錄因子結構域的基因VdFTF1，通過構建 VdFTF1缺失突變體，發現突變體生長速度、孢子形態以及黑色素產生都沒有改變，但突變體的致病力顯著下降。轉錄組測序分析發現，VdFTF1對 802 個基因具有表達調控作用，其中包括分泌蛋白、碳水化合物降解酶和一些致病關鍵因子。進一步研究表明，VdFTF1通過調控細胞壁降解酶的合成來影響大麗輪枝菌的致病過程[28]。

轉錄因子Crz1是真菌中 Ca2+信號轉導的重要下游調控因子，轉錄因子Crz1含有2個典型的C2H2鋅指，并作為Ca2+信號轉導的主要介質來調節鈣調磷酸酶依賴性基因的表達。轉錄因子Crz1的同源物在許多真菌中被鑒定，參與了孢子形成、信號轉導、致病性等重要的生物學功能。對大麗輪枝菌中Crz1的同源基因VdCrz1進行研究，發現VdCrz1基因參與大麗輪枝菌微菌核的形成、Ca2+信號的傳導和病原菌的致病性[29]。大麗輪枝菌中的轉錄調節子VdSge1的缺失能夠導致其在番茄寄主上的毒力下降，并可以使得菌絲顏色由白色變為棕色，產孢量降低[30]。

轉錄因子Vta2可以調控一些附著蛋白的表達，以此控制其對番茄寄主的根部侵染和定殖，該基因的缺失突變株導致病原菌在寄主根部不能定殖，并使得其致病力降低[31]。轉錄因子Som1和Vta3在大麗輪枝菌的根系滲透和寄主定殖方面發揮著重要作用。Som1調控菌絲的生長發育，病原菌的根部附著、侵入以及定殖以及Vta3基因的表達。Som1和Vta3共同調控著致病性所必需的整個基因表達體系[32]。

這些轉錄調控因子在大麗輪枝菌致病過程中均發揮著重要作用，形成一個復雜的病原菌致病的調控體系。

1.4.2 毒蛋白基因。

大麗輪枝菌在侵染過程中會分泌一些可導致寄主植株萎蔫甚至死亡的毒性蛋白，研究表明黃萎病菌致萎毒素主要是酸性糖蛋白，糖蛋白毒素能夠水解和破壞植物的細胞膜，引起細胞滲透壓的變化及物質的滲出，最終導致植物發病。大量試驗表明，大麗輪枝菌分泌的毒力蛋白包括一些胞外分泌蛋白、細胞壁水解酶、富含半胱氨酸的小分子量蛋白、賴氨酸蛋白等[6]。研究人員在大麗輪枝菌中發現一個編碼毒性蛋白的基因VdNEP[33-35]，與真菌中的壞死與乙烯誘導蛋白的序列具有高度同源性。研究表明，壞死與乙烯誘導蛋白VdNEP 具有產毒素和誘導的雙重功能。VdNEP 蛋白能夠導致煙草葉片萎蔫壞死、激活擬南芥中的水楊酸和乙烯依賴的防御途徑以及誘導棉花中抗毒素的產生。進一步研究發現，大部分大麗輪枝菌菌株含有8～9個VdNLP（NEP-like protein）家族成員，其中只有VdNLP1和VdNLP2可以誘導擬南芥、番茄、棉花、煙草的壞死和防御反應的發生，編碼VdNLP1的基因就是所鑒定VdNEP的同源基因，VdNLP1基因的缺失并不影響菌株的致病力，但營養生長的表型發生改變，突變體會產生更多的氣生菌絲和更少的分生孢子。VdNLP2基因的缺失不改變菌株的營養生長表型，但能夠降低菌株在番茄和擬南芥上的毒力。大麗輪枝菌的VdCP1基因編碼的蛋白屬于 SnodProt1 植物毒素家族[36]，會激活寄主植株的防御反應，缺失VdCP1基因的突變體的致病力較野生型有所降低。分泌蛋白VdLHS是內質網 Hsp70 家族蛋白，LHS蛋白在稻瘟病菌能夠調控多種蛋白的分泌。缺失 VdLHS基因后大麗輪枝菌的胞外蛋白分泌量下降76%，致病力也顯著下降[7]。

1.4.3 效應因子。

在植物和大麗輪枝菌互作的過程中，一方面，植物通過識別病原菌產生的一些分泌物質來啟動自身的免疫防御反應，以阻止病原菌的入侵;另一方面，大麗輪枝菌會編碼一些蛋白應對植物的免疫防御反應，達到侵染的目的。幾丁質是真菌細胞壁的重要組分之一，病原菌所釋放的幾丁質寡糖被寄主的膜受體CERK（receptor chitin elicitor receptor kinase）識別，從而誘發寄主的免疫防御反應。為應對這種防御反應，真菌病原菌會產生效應物LysM，它可以阻止植物識別幾丁質寡糖，從而抑制植物免疫反應[37-38]。研究人員通過比較基因組學在大麗輪枝菌基因組中找到一個特定譜系（LS）基因區域，在這個區域內發現7個編碼 LysM效應子的基因（VDAG_00902、VDAG_03096、VDAG_04781、VDAG_06426、VDAG_06998、VDAG_08171、VDAG_05180），其中VDAG_05180 基因所編碼的蛋白能夠結合幾丁質寡糖，抑制寄主植物體內免疫信號的傳遞和防御反應。VDAG_05180基因的缺失能夠導致菌株的致病力顯著下降，說明VDAG_05180基因在大麗輪枝菌致病過程中發揮著重要作用[39]。特異蛋白VdSCP7被認為大麗輪枝菌中調節植物免疫的一種新型效應蛋白，其定位在植物細胞核中，通過識別VdSCP7蛋白，植物的水楊酸和茉莉酸信號途徑被激活[40]。

最新的研究發現大麗輪枝菌中的聚多糖脫乙酰酶基因（VdPDA1）的缺失突變體能夠顯著降低大麗輪枝菌的毒力。在堿性的體外環境中VdPDA1對可溶性幾丁質寡糖具有很強的脫乙酰酶活性。研究表明，VdPDA1在大麗輪枝菌的侵染早期表達，并在病原菌-寄主侵染界面的菌絲頸處大量積累，VdPDA1通過對幾丁質寡糖的去乙?；?，使得幾丁質寡糖不能被植物寄主的受體所識別，抑制了寄主的免疫反應[41]，揭示了一種新型的致病機制。

1.4.4 無毒基因。

1954年，Flor根據亞麻和亞麻銹病之間的抗病性研究結果，提出了基因-基因學說，即寄主植物中含有抗性基因或感病基因，而病原菌中含有毒性基因或無毒基因，當含無毒基因的病原菌與含抗病基因的寄主發生互作時，無毒基因（avirulence gene，Avr）被抗性基因所識別，激發寄主的免疫反應，寄主表現為抗病，而其他的組合中寄主表現為感病。大麗輪枝菌1號生理小種上的一個片段大小為50 kb的無毒基因Ave1被鑒定，該基因能夠被番茄中抗性基因 Ve1基因蛋白所識別，從而激活了番茄中Ve1基因介導的抗性反應?；蜻M化分析表明，Ave1是由植物水平轉移而來[42]。

1.4.5 激發子。

激發子在病原菌與植物寄主的相互作用以及信號轉導中有重要的作用。激發子是一類小分子物質，包括寡多糖、多肽、蛋白、糖蛋白、磷脂和多糖[43]。激發子在低濃度條件下能夠激活植物防御應答的能力，說明寄主植物上存在受體與之結合，并能夠激活下游的一系列信號反應。激發子在病原菌與植物寄主的相互作用以及信號轉導中起著很關鍵的作用，大麗輪枝菌中VdNEP[29]和VdPevD1[44]具有誘導作用，被證實為激發子，能夠激活寄主植物的免疫反應，并參與棉花與大麗輪枝菌的互作。另外，大麗輪枝菌釋放的線粒體DNase 作為激發子，除了對宿主馬鈴薯具有誘導活性外，對非宿主豌豆也具有誘導抗性的能力。純化的 VdDNase 能夠誘導豌豆果皮中豌豆素和病程相關基因PR-10的表達，通過這種對非宿主植物DNA的改變和損傷，激發非宿主植物的免疫抗性反應[45]。

1.4.6 轉運蛋白。

轉運蛋白對于真菌的致病過程中也發揮著重要作用，一些轉運蛋白與真菌的抗藥性有關，有些轉運蛋白基因的突變會導致病原真菌無法將毒素轉運到寄主體內[46]。超家族轉運蛋白（primary facilitator superfamily transporter，MFS）在真菌的抗藥性方面發揮著重要作用[47]。VdATMT-136是T-DNA插入到MFS基因（VDAG_09647.1）的突變體[48]，與野生型相比，該突變體不能引起萵苣的萎蔫癥狀，說明MFS基因與致病力相關，突變體的研究對于研究真菌的耐藥或耐抗菌物質的特性具有重要意義。硫胺轉運蛋白VdThit基因的缺失突變體的生長速度、產孢量和致病力都有所下降，外源補充硫胺素后這些生物學功能會得到部分恢復。分析顯示，突變體中丙酮酸代謝受到抑制[49]。

2 致病相關基因篩選的策略

2.1 突變體庫中的構建

利用突變體庫的建立得到致病力缺陷突變體，已經成為獲得致病基因的研究熱點。利用農桿菌介導轉化（agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT）方法構建真菌突變體庫已用于50多種真菌，即利用標記片段T-DNA進行隨機插入獲取大量的突變體，從中篩選致病力缺陷的突變體，采用反式PCR（Inverse-PCR）或TAIL-PCR 方法獲得 T-DNA 插入位點側翼序列并分析突變位點。ATMT方法已經被成功用于大麗輪枝菌的遺傳轉化、基因定點突變和功能研究[50]。Maruthachalam 等[48]構建了萵苣黃萎病菌 VdLs.17 的 T-DNA 插入突變體庫，并從獲得的181個突變體中篩選出一些致病力顯著下降的突變體，鑒定出內切葡聚糖酶VdEg-1（endoglucanase1）、羥甲基戊二酰輔酶 A合成酶VdHMGS（a hydroxyl-methyl glutaryl-Co A synthase）、超家族轉運蛋白 VdMFS1（a major facilitator superfamily 1）和糖基化磷脂酰肌醇轉移酶 VdGPIM3（a glycosylphosphatidylinositol mannosyltransferase）等致病相關基因。徐榮旗等[51]構建了大麗輪枝菌Vd991的 T-DNA 插入突變體庫，獲得了在 PDA 培養基上不同生長表型的突變體。Gao等[16]通過構建落葉型大麗輪枝菌V592的T-DNA 插入突變體庫，驗證了一些基因的功能，如與微菌核形成相關的基因GARP1，與致病性相關的基因DVK1等。

2.2 同源基因的克隆

根據已報道或已克隆其他病原菌的致病相關基因，在大麗輪枝菌基因組中找到相應的同源基因，通過基因敲除的方法獲得突變體，將突變體與野生型菌株的生長表型和致病力進行比較，進而判斷基因的功能。比如，影響大麗輪枝菌致病力的蔗糖非發酵蛋白激酶基因VdSNF1[12];影響微菌核的形成和致病力的MAPK家族基因VMK1[9];影響大麗輪枝菌營養生長和致病力的壞死和乙烯誘導蛋白基因[29]。

2.3 致病性鑒定方法

將相關基因敲除或者過量表達獲得突變體是研究基因功能的基本方法，通過鑒定突變體的致病能力來驗證基因的功能，就需要建立快速、有效的鑒定方法。以棉花為寄主，目前鑒定菌株致病力的方法主要有田間病圃鑒定法和溫室苗期鑒定法。田間病圃鑒定法由于易受到多方面環境因子和季節的影響，一般不予采納。溫室苗期鑒定法主要有針刺接菌法、紙缽撕底法、無底塑缽菌液澆根法、蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法、毒素鑒定法等[52-53]。溫室苗期鑒定法不受時間和季節的限制，可以開展規?；ぷ?，但容易出現接菌不均一、周期長等方面的問題。

農業農村部華中作物有害生物綜合治理重點實驗室建立了一種大麗輪枝菌的致病力鑒定的新方法。用棉花基質育苗至2片真葉，將幼苗從基質中取出，裸根接種大麗輪枝菌的孢子液后，又重新移栽無土基質中。這種方法的優點在于：①棉苗根系與病菌充分的接觸，保證傷根均勻;②此方法鑒定快速，一般接種后7～10 d就能出現癥狀，縮短了鑒定周期。

3 總結與展望

研究大麗輪枝菌致病相關基因以及致病機理具有重大的理論和實際意義。一方面，從已克隆的致病基因的功能來看，有些致病基因除影響病原菌的致病力外，還對營養體和休眠體的結構產生影響，如孢子的產量、菌絲的產生、微菌核和黑色素的形成等，因此研究病原菌的致病基因可以為研究病原菌的長期存活與演化提供依據。另一方面，通過研究大麗輪枝菌的致病基因及所編碼的蛋白，將有助于弄清病原菌一些關鍵的生化途徑和信號途徑，揭示病原菌和寄主的相互關系和互作機制，進而深入的解析致病機制，為開發新型農藥或者有針對的使用農藥防治該病害奠定基礎。

大麗輪枝菌的致病過程是一個多基因調控的結果，是一個復雜的網絡調節系統。對致病基因和致病機理進行更加深入的研究，將有助于找到控制病害的有效方法。

參考文獻

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