低溫刺激對不同溫型香菇發酵液菌株酶活性的影響

王曉敏， 陳 旭*， 曾 茜

(1.貴州省農業科學院 農業資源與環境研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.貴州中醫藥大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州大學 農學院食用菌研究院， 貴州 貴陽 550006)

香菇(Lentinulaedodes)隸屬蘑菇綱(Agaricomycetes)、蘑菇目(Agaricales)、類臍菇科(Omphalotaceae)、微香菇屬(Lentinula)，是我國主要的食用菌之一[1]。香菇屬低溫、變溫結實性菌類，香菇原基形成需要有一定的晝夜溫差刺激，晝夜溫差大，子實體原基數目越多。所需要的溫度由香菇品系所決定。因此，溫度成為影響香菇生長和品質的限制因素[2]。纖維素酶是降解基質纖維素的主要酶類，可將纖維素分解成小分子物質供菌絲體生長發育。過氧化氫酶和多酚氧化酶在木質素降解中起重要作用，其活性越強，菌株降解木質素的能力就越強[3-4]，少見低溫刺激對各溫型香菇發酵液菌株酶活性的影響的研究報道，探明其作用機制具有重要意義。為此，以香菇發酵液菌株為材料，研究低溫刺激對不同溫型香菇發酵液菌株纖維素酶、過氧化氫酶和多酚氧化酶活性的影響，為低溫刺激不同溫型香菇發酵液菌株酶活性變化的深入研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

香菇菌種等：高溫型香菇發酵液菌株XN01和低溫型香菇發酵液菌株2091，由貴州省土壤肥料研究所提供；馬鈴薯，購于金竹農貿市場。

試劑：葡萄糖、蛋白胨、瓊脂和維生素B1，購于索萊寶；磷酸二氫鉀、硫酸鎂、鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、愈創木酚和過氧化氫，購于貴州愛瑞特生物科技有限公司。

儀器：超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；培養箱和水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；滅菌鍋，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；pH計和紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1 香菇發酵液菌株的培養 液體培養基配方：每100 mL中，馬鈴薯20 g、葡萄糖20 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂1 g和維生素B10.5 g，121℃滅菌30 min。2個不同溫型香菇發酵液菌株分別接種至液體配方，120 r/min，25℃培養5 d，再于10℃、15℃、20℃和25℃條件刺激培養1 d。

1.2.2 粗酶液的提取 將菌絲體用RO水沖洗，濾除水分，低溫烘干，取2 g干菌絲，適當研磨后移入試管中，加RP水20 mL，在水浴鍋中37℃浸提2 h，定容至25 mL，4℃ 8 000 r/min冷凍離心10 min，取上清分裝，于-80℃保存備用[5]。

1.2.3 酶活性測定 多酚氧化酶參照文獻[6]的方法測定，在2 mL離心管中加入500 μL 0.1 mmol鄰苯二酚和500 μL 0.05 mol(pH 6.0)磷酸緩沖液，加入粗酶液500 μL，28℃水浴30 min，8 000 r/min離心5 min，于 400 nm處比色，觀察并記錄結果。過氧化氫酶參照文獻[7]方法測定，取2 mL離心管加入100 μL粗酶液，200 μL 25 mmol/L愈創木酚溶液，50 μL的0.5mol/L的過氧化氫溶液，于470 nm處比色，觀察并記錄結果。纖維素酶參照文獻[8]的方法測定，取2 mL離心管，每個管中加入濾紙1 cm×1.2 cm，加入0.05 mol/L檸檬酸緩沖液200 μL，加入粗酶液200 μL，50℃水浴1 h，取出后加入DNS 300 μL，100℃煮沸5 min，定容至5 mL，于 520 nm處比色，觀察并記錄結果。

1.3數據處理

采用SPSS 21.0分析數據，并對不同樣品進行差異性分析。

2結果與分析

2.1不同溫度對2種香菇菌絲多酚氧化酶活性的影響

從圖1看出，不同低溫刺激處理下，隨著處理溫度的降低，高溫型香菇發酵液菌株XN01和低溫型香菇發酵液菌株2091多酚氧化酶活性均呈下降趨勢，均以10℃最低，分別為59.3%和67.7%；25℃最高，分別為100%和93.0%；其中，當處理溫度≤20℃時低溫型香菇發酵液菌株2091多酚氧化酶活性一直高于高溫型香菇發酵液菌株XN01。表明，低溫刺激會降低香菇發酵液菌株的多酚氧化酶活性。

注：酶活性均以最高時為100%，下同。

2.2不同溫度對2種香菇菌絲過氧化氫酶活性的影響

從圖2看出，不同低溫刺激處理下，隨著處理溫度的降低，高溫型香菇發酵液菌株XN01和低溫型香菇發酵液菌株2091過氧化氫酶活性均呈降低趨勢，均以10℃最低，分別為48.3%和45.2%；25℃最高，分別為100%和94.6%。其中，2個香菇發酵液菌株過氧化氫酶活性除15℃時相近外，其余溫度下低溫型香菇發酵液菌株2091過氧化氫酶活性一直高于高溫型香菇發酵液菌株XN01。經方差分析，25℃處理香菇發酵液菌株過氧化氫酶活極顯著高于10℃、15℃和20℃。

圖2不同溫度刺激培養2個香菇液體菌株的過氧化氫酶活性

2.3不同溫度對2種香菇菌絲纖維素酶活性的影響

從圖3看出，不同低溫刺激處理下，隨著處理溫度的降低，高溫型香菇發酵液菌株XN01和低溫型香菇發酵液菌株纖維素酶活性均呈下降趨勢，相同溫度刺激下，高溫型香菇發酵液菌株XN01纖維素酶活性均高于低溫型香菇發酵液菌株2091，2個香菇發酵液菌株纖維素酶活性均以10℃最低，分別為83.2%和74.2%；25℃最高，分別為100%和96.1%?？梢?，低溫刺激會降低香菇發酵液菌株纖維素酶的活性。

圖3不同溫度刺激培養2個香菇液體菌株的纖維素酶活性

3小結

研究結果表明，10℃、15℃、20℃和25℃條件刺激培養1 d，隨著處理溫度的降低，2個香菇發酵液菌株多酚氧化酶、過氧化氫酶和纖維素酶活性均呈下降趨勢，說明低溫環境下酶促反應降低。其中，當處理溫度≤20℃時低溫型香菇發酵液菌株2091多酚氧化酶活性一直高于高溫型香菇發酵液菌株XN01，表明高溫型香菇發酵液菌株XN01的多酚氧化酶活性對溫度更敏感；2個香菇發酵液菌株過氧化氫酶活性除15℃時相近外，其余溫度下低溫型香菇發酵液菌株2091過氧化氫酶活性一直高于高溫型香菇發酵液菌株XN01；相同溫度刺激下，高溫型香菇發酵液菌株XN01纖維素酶活性均高于低溫型香菇發酵液菌株2091?？傮w看，不同溫型香菇發酵液菌株的酶活性對低溫刺激的響應強度不同，高溫型菇不宜用過低溫度對其進行刺激。