水楊酸對秦艽愈傷組織總酚?總黃酮含量及抗氧化酶活性的影響

雷瑞祥 楊冰月 胡本祥 高靜 魏艷妮 曹福麟 羅露 李潔 張崗 劉清 彭亮

摘要 [目的]研究添加不同濃度的水楊酸（SA）對秦艽愈傷組織生長量、總黃酮、總酚含量及抗氧化酶活性的影響。[方法]以秦艽種子為原材料誘導出秦艽愈傷組織，在秦艽愈傷組織的繼代培養中加入0、10、50、100、150、200 μmol/L的SA，暗培養25 d后，測定秦艽愈傷組織的生長量、抗氧化酶活性和總黃酮、總酚含量。[結果]與對照組相比，當SA濃度為150 μmol/L時秦艽愈傷組織鮮重達到最大值，SA濃度為100 μmol/L時秦艽愈傷組織干重達到最大值，分別為2.863 5、0.201 7 g，顯著高于對照組的鮮重和干重（P<0.05）。秦艽愈傷組織SOD活性在SA濃度為150 μmol/L時達到最大值，為183.95 U/g，是對照組的2.44倍;CAT活性在SA濃度為200 μmol/L時達到最大值，為22.44 U/mg，是對照組的2.56倍;當SA濃度為200 μmol/L時，POD活性雖有所上升，但仍然顯著低于對照組（P<0.05），為61.16 U/mg，是對照組的0.40倍。SA濃度為100 μmol/L時，秦艽愈傷組織總黃酮含量達到最大值，為0.77 mg/g，是對照組的1.35倍;SA濃度為50 μmol/L時，總酚含量達到最大值，為0.98 mg/g，是對照組的1.31倍。[結論]一定濃度的SA處理下，有利于秦艽愈傷組織的生長和干物質的積累;適當濃度的SA對秦艽愈傷組織SOD、CAT活性有促進作用，而添加SA會對POD活性有抑制作用;當添加SA濃度為100、50 μmol/L時，分別有利于秦艽愈傷組織中總黃酮、總酚含量的積累。

關鍵詞 秦艽;愈傷組織;水楊酸;總酚;總黃酮;抗氧化酶活性

中圖分類號 R284文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2021）02-0165-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.045

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of Salicylic Acid on Total Phenol， Total Flavonoids Content and Antioxidant Enzyme Activities in Callus of Gentiana macrophylla

LEI Ruixiang，YANG Bingyue，HU Benxiang et al

（School of Pharmacy， Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine，Qinling Chinese Herbal Medicine Application Development Engineering Technology Research Center， Xianyang，Shaanxi 712046）

Abstract [Objective]To study the effects of different concentrations of salicylic acid （SA） on callus growth， total flavonoids， total phenolic content and antioxidant enzyme activities of Gentiana macrophylla.[Method]The callus of Gentiana macrophylla was induced by the seeds of Gentiana macrophylla. The SA of 0， 10， 50， 100， 150， 200 μmol/L was added to the subculture of Gentiana macrophylla callus. Growth， antioxidant enzyme activity and total flavonoids， total phenolic content was determined after 25 days of dark culture. [Result]Compared with the control group， when the concentration of SA was 150 μmol/L， the fresh weight of callus reached the maximum. When the concentration of SA was 100 μmol/L， the dry weight of callus reached the maximum， which was 2.863 5 and 0.201 7 g， respectively. Significantly （P < 0.05） higher than the fresh weight and dry weight of the control group. The SOD activity of Gentiana macrophylla callus reached a maximum of 183.95 U/g at a concentration of 150 μmol/L， which was 2.44 times that of the control group. The CAT activity reached a maximum at a concentration of 200 μmol/L， which was 22.44 U/mg. The group was 2.56 times;when the concentration of SA was 200 μmol/L， the activity of POD increased， but it was still significantly lower than that of the control group （P<0.05）， which was 61.16 U/mg， which was 0.40 times of the control group. When the concentration of SA was 100 μmol/L， the total flavonoid content of callus reached the maximum， which was 0.77 mg/g， which was 1.35 times of the control group. When the concentration of SA was 50 μmol/L， the total phenolic content reached the maximum. 0.98 mg/g was 1.31 times that of the control group.[Conclusion]A certain concentration of SA treatment is beneficial to the growth and dry matter accumulation of callus in Gentiana macrophylla. The appropriate concentration of SA can promote the activity of SOD and CAT in callus of Gentiana macrophylla， and the addition of SA can inhibit the activity of POD. When the concentration of SA was 100 and 50 μmol/L， it was beneficial to the accumulation of total flavonoids and total phenols in callus of Gentiana macrophylla.

Key words Gentiana macrophylla;Callus;Salicylic acid;Total phenol;Total flavonoids;Antioxidant enzyme activity

中藥材秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）為龍膽科龍膽屬植物，既是我國的傳統中藥材，也是國家重點保護的中藥材品種之一，主產于陜西、甘肅、四川、內蒙古等地[1]。秦艽始載于《神農本草經》，列為中品，《神農本草經》曰：“（秦艽）主寒熱邪氣，寒濕風痹，肢節痛，下水利小便?！盵2]性苦平，微寒，歸胃、肝、膽經，以根入藥，具有祛風除濕、活血舒筋、清熱利尿的功效，其藥理研究主要集中在治療風濕痹痛、筋脈拘攣、骨蒸潮熱、濕熱黃疸等病癥[3]。近年來，由于人們對于野生秦艽藥材的過度采挖，導致秦艽的野生資源分布大大減少[4]，雖然秦艽的人工種植已有研究報道[5]，但是由于秦艽的種質資源混亂，造成了秦艽的種質退化，藥材質量參差不齊，極大地影響了秦艽的產業化發展。植物組織培養技術能以少量的組織材料在短時間內進行大量增殖，且不受季節天氣的影響[6]，已經被用于多種藥用植物的快速增殖之中，如天山雪蓮[7]、南方紅豆杉[8]等。

從細胞培養的角度來講，誘導子是指能促進植物細胞產生目的產物的因子，其中包括生物誘導子和非生物誘導子[9]，利用誘導子來提高植物細胞的次生代謝產物現在已經在甘草[10]、黃芪[11]等中藥材中。水楊酸（salicylic acid，SA）作為一種非生物誘導子，在植物次生代謝過程中以特定的生化信號快速地、選擇性地誘導特定基因表達，調節植物細胞的次生代謝產物合成[12]，已經被用于黃芩[13]、丹參[14]等藥用植物的細胞培養之中。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）是植物體內廣泛存在的3種抗氧化酶。植物可通過提高其體內抗氧化酶活性從而減輕膜質過氧化程度，進而有效誘導植物防御反應的產生，最終影響次生代謝產物的合成與積累[15]。

該試驗以秦艽種子為材料誘導秦艽愈傷組織，添加不同濃度的SA進行處理，探討SA對秦艽愈傷組織生長、總酚、總黃酮含量及抗氧化酶活性的影響，為秦艽愈傷組織的優良品系培養及次生代謝產物的生產提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。

秦艽種子購于陜西省銅川市王益區藥材采購供應站，由陜西中醫藥大學中藥鑒定教研室胡本祥教授鑒定為龍膽科植物秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）的干燥成熟種子。

1.1.2 試劑。

MS 基本培養基（北京康倍斯科技有限公司，批號 B0017K0315008）;二氯苯氧乙酸2，4-D（上海藍季生物有限公司，批號 B00009）;6-芐氨基腺嘌呤6-BA（上海藍季生物有限公司，批號B00004）;SA（源葉生物科技有限公司，批號Z22J9Y64166）;蘆?。ㄖ袊称匪幤窓z定研究院，批號 201508）;沒食子酸（中國食品藥品檢定研究院，批號 201701）;無水乙醇、次氯酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉，天津市天力化學試劑有限公司;福林酚試劑（上海荔達生物科技有限公司，批號 PRLB09500）;蛋白定量、總超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒，批號分別為20190621、20190428、20190508、20190509，均購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器。

生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）;SW-CJ-1FD潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;GR60DA 型立式自動壓力蒸汽滅菌器（廈門致微儀器有限公司）;FA2104型電子分析天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）;SIM-F140ADL型制冰機（Panasonic）;Centrifuge 5804R型離心機（Eppendorf）;DZKW-D-4型電熱恒溫不銹鋼水浴鍋（上?？坪銓崢I發展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 秦艽無菌苗的培養。

將秦艽種子用水浸泡12 h后放置于無菌操作臺，在操作臺中用75%乙醇消毒10 s，無菌水清洗3～4次，再放入2%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，無菌水沖洗5～6次。將消毒好的秦艽種子用無菌濾紙吸干其表面水分，接種于不添加任何激素的MS固體培養基上，于光照強度 2 000 lx、光照條件 12 h/d 的（25±1）℃生化培養箱中培養，待無菌苗長至5～7 cm高時，可以作為誘導秦艽愈傷組織的外植體備用。

1.2.2 秦艽愈傷組織的誘導。

選擇長勢良好的秦艽無菌苗，在無菌操作臺中做以下處理。使用滅菌后的鑷子和剪刀將秦艽的葉片剪切成0.5 cm×0.5 cm的形狀，接種于MS固體培養基（MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L+30 g/L蔗糖+8 g/L 瓊脂）中。將誘導秦艽愈傷組織的組培瓶放置于濕度（65+5）%、溫度（25±5）℃的生化培養箱中暗培養25 d，待愈傷組織誘導形成后繼代3次，作為該試驗的材料，繼代用的MS固體培養基為MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L+30 g/L 蔗糖+8 g/L瓊脂。

1.2.3 SA誘導子誘導秦艽愈傷組織。

定量稱取秦艽愈傷組織，接種于含有濃度分別為0、10、50、100、150、200 μmol/L的SA的MS培養基（MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L+30 g/L 蔗糖+8 g/L瓊脂）中，每個濃度設置3個重復，于濕度（65+5）%、溫度（25±5）℃的生化培養箱中暗培養25 d。

1.2.4 秦艽愈傷組織生長量的測定。

當秦艽愈傷組織生長25 d后從組培瓶中取出，用濾紙吸干表面水分，稱其鮮重質量，再放入40 ℃的烘箱中烘至恒重，取出，稱其干重。以SA濃度為橫坐標、秦艽愈傷組織鮮重和干重為縱坐標，繪制秦艽愈傷組織生長曲線。

1.2.5 抗氧化酶活性的測定。

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[16]，POD活性測定采用愈創木酚比色法[16]，CAT活性測定采用紫外可見分光光度法[16]，SOD活性測定采用氮藍四唑光化學還原法[16]，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.6 總黃酮含量的測定。

1.2.6.1 供試品溶液的制備。將干燥至恒重的秦艽愈傷組織用研缽研成細粉，精密稱取0.1 g粉末至50 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇3 mL，超聲40 min，2 000 r/min離心10 min，取上清液至50 mL錐形瓶中，藥渣再加入3 mL 70%乙醇超聲提取，提取3次，合并3次上清液，放入4 ℃的冰箱里備用。

1.2.6.2 對照品溶液的制備。精準稱取蘆丁對照品0.010 9 g，置10 mL容量瓶中，加80%乙醇定容至刻度線，制成濃度為1.09 mg/mL 的蘆丁對照品，放入4 ℃的冰箱里備用。

1.2.6.3 標準曲線的繪制。用移液槍分別精準吸取0、100、200、300、400、500 μL的蘆丁對照品至干燥的離心管中，加入80%乙醇使其初始體積為2.6 mL，隨后向試管中加5%的亞硝酸鈉試劑0.6 mL，反應6 min，加10%的硝酸鋁試劑0.6 mL，反應6 min，最后加入4.2 mL 4%的氫氧化鈉溶液，充分混勻放置20 min后在波長為510 nm的紫外分光光度計下測定吸光度。以蘆丁含量為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制蘆丁的標準曲線，其線性回歸方程為Y=1.498 6X-0.000 5（R2=0.999 9）。

1.2.6.4 樣品中總黃酮含量的測定。取待測供試品溶液各2.6 mL于10 mL離心管中，按照“1.2.6.3”下對蘆丁對照品的檢測方法，測定各供試品的吸光度，分別計算出各供試品中的總黃酮含量。

1.2.7 總酚含量的測定

1.2.7.1 供試品溶液的制備。制備方法同“1.2.6.1”方法。

1.2.7.2 對照品溶液的制備。精準量取0.012 4 g的沒食子酸對照品至10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線處，制成濃度為1.240 mg/mL的沒食子酸對照品，保存在4 ℃下的冰箱里備用，將濃度稀釋為0.124 0 mg/mL時使用。

1.2.7.3 標準曲線的繪制。采用Folin-Ciocalteu試劑法，配制系列質量濃度的沒食子酸對照品溶液。用移液槍分別精準量取沒食子酸對照品溶液0、100、200、300、400、500 μL加入干燥的10 mL離心管中，加蒸餾水至初始體積為4.0 mL，隨后向離心管中依次加入1 mL 1.0 mg/mL的FC和3 mL 7.5%的碳酸鈉溶液，在40 ℃的水浴鍋中保溫1 h，取出放涼后在紫外波長為765 nm下測吸光度。以沒食子酸含量為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制沒食子酸的標準曲線，其線性回歸方程為Y=14.242X+0.014（R2=0.999）。

1.2.7.4 樣品中總酚含量的測定。測定前，將配制好的樣品溶液濃度稀釋為1.0 mg/mL，精準量取4.0 mL的樣品溶液，置于干燥的離心管中，按“1.2.7.3”方法處理后測定吸光度，將所測吸光度代入標準曲線中，計算總酚含量。

1.3 數據分析及處理

使用Excel 2010對數據進行回歸分析，SPSS 19.0進行數據處理，Original 8.0進行繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的SA對秦艽愈傷組織生長的影響

由表1可知，秦艽愈傷組織接種到含不同濃度SA的MS培養基上暗培養25 d后，其鮮重、干重均有不同程度的增加。與對照組相比，當SA濃度為150 μmol/L時秦艽愈傷組織鮮重達到最大值，SA濃度為100 μmol/L時秦艽愈傷組織干重達到最大值，分別為2.863 5、0.201 7 g，顯著高于對照組的鮮重和干重（P<0.05）。說明當添加SA濃度為150 μmol/L時，有促進秦艽愈傷組織生長的作用，而當添加SA濃度為100 μmol/L時，更有利于秦艽愈傷組織干物質含量的積累。

2.2 不同濃度的SA對秦艽愈傷組織SOD活性的影響

從圖1可以看出，與對照組相比，隨著SA濃度的增加，秦艽愈傷組織SOD活性總體呈現先增大后減小再增大再減少的趨勢。SOD活性在SA濃度為150 μmol/L時達到最大值（183.95 U/g），是對照組的2.44倍。隨著SA濃度的逐漸增大，SOD活性呈現逐漸降低的現象，當SA濃度為100和200 μmol/L時，SOD活性顯著低于對照（P<0.05），這說明在SA濃度為150 μmol/L時可以促進秦艽愈傷組織SOD活性，而過高的SA濃度（200 μmol/L）則會抑制SOD活性。

2.3 不同濃度的SA對秦艽愈傷組織CAT活性的影響

從圖2可以看出，與對照組相比，隨著SA濃度的增大，秦艽愈傷組織CAT活性基本呈現先減小后增大的趨勢。CAT活性在SA濃度為200 μmol/L時達到最大值，為22.44 U/mg，是對照組的2.56倍;當SA濃度為10 μmol/L時，CAT活性達到最小值（4.65 U/mg），顯著低于對照組（P<0.05）;說明低濃度的SA抑制CAT活性，而高濃度的SA促進CAT活性。

2.4 不同濃度的SA對秦艽愈傷組織POD活性的影響

從圖3可以看出，與對照組相比，隨著SA濃度的增大，秦艽愈傷組織POD活性呈現先減小后增大的趨勢，但均低于對照。POD活性在SA濃度為100 μmol/L時達到最低值，為20.54 U/mg，僅為對照組的0.14倍。當SA濃度為200 μmol/L時，POD活性雖有所上升，但仍然顯著低于對照組（P<0.05），說明添加不同濃度的SA對秦艽愈傷組織POD活性有抑制作用。

2.5 不同濃度的SA對秦艽愈傷組織總黃酮含量的影響

從圖4可以看出，與對照組相比，隨著SA濃度的增大，秦艽愈傷組織總黃酮含量呈現先增大后減少的趨勢。SA濃度為10、50、100、150 μmol/L時，總黃酮含量顯著高于對照組含量（P<0.05），其中SA濃度為100 μmol/L時，總黃酮含量達到最大值，為0.77 mg/g，是對照組的1.35倍。SA濃度為200 μmol/L時，總黃酮含量為最小值，是0.53 mg/g，顯著低于對照組（P<0.05）。說明低濃度的SA可以促進秦艽愈傷組織總黃酮含量的積累，而高濃度的SA則會抑制其總黃酮含量的積累。

2.6 不同濃度的SA對秦艽愈傷組織總酚含量的影響

從圖5可以看出，與對照組相比，隨著SA濃度的增大，秦艽愈傷組織總酚含量呈現先增大后減少的趨勢。SA濃度為10、50、100、150、200 μmol/L時，總酚含量顯著高于對照組含量（P<0.05），其中SA濃度為50 μmol/L時，總酚含量達到最大值，為0.98 mg/g，是對照組的1.31倍。SA濃度為10、150 μmol/L時，兩組總酚含量之間無顯著性差異（P>0.05），顯著低于除對照組外的其他試驗組（P<0.05），而又顯著高于對照組（P<0.05）。

3 討論與結論

愈傷組織具有結構松散、容易分離、成本低等特點，可以節約土地資源、降低生產周期，有利于實現植物次生代謝產物的工業化生產[17]。近年來，應用植物組織培養技術生產用于預防和治療疾病的植物次生代謝產物發展十分迅速，已經在甘草[18]、雷公藤[19]、杜仲[20]等藥用植物研究方面取得了良好的成果。水楊酸（SA）作為一種非生物誘導子可誘導多種植物次生代謝物合成積累量的增加[21]，一定濃度的水楊酸誘導子可以通過改變植物次生代謝物合成途徑上關鍵酶的活性來提高次生代謝物的合成積累量[22]，這一點已經在遠志[12]、黃芩[13]等植物上得以體現。

該試驗以秦艽愈傷組織為原材料，考察了不同濃度的SA對秦艽愈傷組織生長、抗氧化酶活性、總黃酮和總酚含量的影響。結果表明，添加一定濃度的SA對秦艽愈傷組織的生長具有促進作用，其中SA濃度為150、100 μmol/L時，秦艽愈傷組織鮮重和干重分別達到最大值，分別為2.863 5、0.201 7 g，與對照組相比具有顯著性差異（P<0.05），說明適當濃度的SA促進秦艽愈傷組織的生長，而當SA達到一定濃度時，則會對秦艽愈傷組織的生長產生抑制作用，這一點與李潔等[12]的研究結果基本一致。

SOD、POD、CAT被稱為植物體內的抗氧化保護酶，主要作用是清除細胞內的活性氧（ROS）[23]，SOD的主要功能是清除植物體內的超氧陰離子，降低氧自由基對細胞膜的系統傷害[16];POD和CAT可以及時清除細胞內過量H2O2，使H2O2轉化為H2O，對維持細胞活性氧的代謝平衡起著關鍵作用[13]。該試驗研究結果表明，隨著SA濃度的增大，SOD活性呈現先增大后減小再增大再減少的趨勢，總體表現為先增大后減少，這與孟書亦等[13]的研究結果基本一致;CAT活性與對照組相比，呈現先減少后增大的趨勢;POD活性與對照組相比，呈現先減少后增大的趨勢，但均低于對照，這一點與孟書亦等[13]的研究結果也是一致的。當SA添加量為150 μmol/L時，SOD活性達到最大值，清除植物體內有毒害作用的超氧陰離子;隨著SA濃度增大到200 μmol/L時，SOD活性降低，CAT和POD活性增加，兩者起著協同作用清除植物體內多余的H2O2，從而減少其對植物細胞的傷害。

不同濃度的SA對秦艽愈傷組織中總黃酮、總酚含量的影響具有顯著性差異（P<0.05），隨著SA濃度的增大，與對照組相比，總黃酮、總酚含量呈現先增大后減小的趨勢。在SA濃度為100 μmol/L時，總黃酮含量達到最大值，為0.77 mg/g，是對照組的1.35倍;SA濃度為50 μmol/L時，總酚含量達到最大值，為0.98 mg/g，是對照組的1.31倍;說明一定濃度的SA能促進秦艽愈傷組織總黃酮、總酚含量的積累，而當SA濃度過高，則不利于總黃酮、總酚含量的積累。該試驗結果表明，當添加SA濃度為100、50 μmol/L時，分別有利于秦艽愈傷組織中總黃酮、總酚含量的積累。

該試驗以秦艽愈傷組織為原材料，通過添加不同濃度的SA，考察不同濃度的SA對秦艽愈傷組織生長量、總黃酮、總酚含量及抗氧化酶活性的影響，為以后進一步研究秦艽愈傷組織次生代謝產物積累和調控奠定了基礎，也為秦艽愈傷組織優良品系的培育和秦艽愈傷組織規?；纳a提供一定的參考。

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