植物蛋白水解及在熱反應肉味基料中應用進展

王羽桐，趙 銀，李 健，李 娟，杜文斌，譚 佳，謝建春

（北京食品營養與健康高精尖創新中心，食品質量與安全北京實驗室，北京工商大學輕工科學技術學院，北京 100048）

肉味香精為具有肉類風味的食品添加劑，其廣泛應用于方便食品、肉制品、調味品等食品中。20世紀80年代，為適應方便面工業的快速發展，以水解植物蛋白（Hydrolyzed Vegetable Protein，HVP）、氨基酸與還原糖熱反應制備肉味基料再輔以調香制備的肉味香精，稱為第一代肉味香精，特點是“非肉源”、香氣濃郁、價格低廉，但缺少真實肉味道。90年代起，“非肉源”肉味香精逐漸被取代，開始以水解動物蛋白（Hydrolyzed Animal Protein，HAP）經熱反應制備肉味基料，然后輔以調香制備肉味香精，產品滿足了人們對肉味道的需求，此稱為第二代肉味香精。在此基礎上，為進一步得到不同種動物肉的特征風味，人們在熱反應體系中又添加調控氧化的動物脂肪制備熱反應肉味基料，由此技術制備的肉味香精被稱為第三代肉味香精[1]。熱反應制備肉味基料中，美拉德反應與脂質氧化反應為形成肉風味的主要反應，且二者之間還發生復雜的交互作用，其中含氨基化合物（主要是半胱氨酸或含半胱氨酸的肽）與還原糖發生美拉德反應產生的含硫化合物是肉香味主要來源，肉類脂質（包括磷脂、甘油酯）氧化降解產生的小分子醛、酮等羰基化合物對特征肉香味有貢獻，而小分子羰基化合物參與美拉德反應還可生成新的雜環化合物，從而使肉香味豐富濃郁，像真性好[2]。

圖1為從1980到2019年檢索的國內外與HVP和熱反應肉味香精制備有關的文獻報道趨勢，其中“非肉源”指僅涉及HVP風味及以HVP為主要原料（不含HAP）制備熱反應肉味香精的文獻，“肉源”為制備熱反應肉味香精時不僅涉及到HVP還涉及到HAP的文獻。

由圖1可知，有關HVP風味與僅以HVP為原料制備肉味基料的論文，國外出現較早，并于2009年后數量迅猛增長，而專利數量一直不多。國內1996年后論文開始出現，直到2016年，論文數量一直處于迅猛增長趨勢，2017～2019年迅速下降；而專利數一直處于上升趨勢。有關采用肉水解物為原料制備肉味基料的論文，國外報道一直較少，國內報道較多。國內在2005～2007年論文數量達到峰值，2013后趨于平穩，而專利數在2011～2013年數量達到峰值，2013年后迅速下降。

總之，與國外相比，我國HVP的開發利用起步較晚。近年來國內外有關HVP風味及非肉源肉味基料的專利數迅速增長，與素食食品的興起有一定關系。

近年來采用素肉香精制備的仿肉食品，如素肉餅、素肉香腸等，由于低鹽低脂低膽固醇且加工過程安全，受到素食主義者與患有“三高”類健康疾病的人喜愛。HVP由植物蛋白經酸法或酶法水解制備，生產成本低而富含多種氨基酸、多肽，是制備素肉類肉味香精的主要原料。然而，現階段制備的素肉香精產品存在僅能部分模擬真實肉風味的問題，故本文針對迄今國內外關于HVP制備工藝，和不采用動物性原料，僅以HVP為原料制備熱反應肉味基料的工藝研究現狀及檢測的風味物質進行概述，為研發新型的僅以植物蛋白為原料制備肉味基料的工藝提供借鑒。

圖1 國內外HVP風味及HVP在制備肉味香精中應用的文獻發展趨勢Fig.1 Trend of literature related to HVP flavor and HVP used in preparation of thermal reaction meat flavorings in the world

1 HVP制備工藝

植物蛋白種類繁多，營養豐富，易被人體消化吸收，是理想的蛋白質來源。植物蛋白來源廣泛，可分為水果、蔬菜、菌類、糧食類，其中易獲得且蛋白質含量高的植物蛋白種類更受青睞。目前國內外主要以大豆、小麥等糧食類蛋白為熱反應肉味基料制備原料。為降低成本，一般選用大豆榨油后剩余的豆粕、小麥脫皮后剩余的麥麩等初加工副產物進行水解以制備大豆HVP和小麥HVP。

常用HVP包括酸水解法制備的酸解植物蛋白（Acid Hydrolyzed Vegetable Protein，aHVP）與酶水解法制備的酶解植物蛋白（Enzymatic Hydrolyzed Vegetable Protein，eHVP）。酸法比酶法水解度高，如Aaslyng等[3]比較酸法和酶法水解大豆蛋白，得出酸法水解度為78.2%，酶法為65.5%。酸解法得到的HVP游離氨基酸含量往往高于酶解法，但肽含量小于酶解法[4]。為便于貯藏，HVP溶液常采用噴霧干燥法制備成粉[5]。噴霧干燥工藝條件對HVP產品風味有影響，噴霧干燥過程中還可添加其他原料調整HVP產品的風味[6]。也可采用冷凍干燥法將HVP溶液脫水成粉狀，冷凍干燥與噴霧干燥的產品風味有明顯不同[7-8]。近年來堿水解植物蛋白作為新水解方法得到研究，馮云龍等[9]使用濃度為2%的NaOH水解葵花籽粕蛋白，但所得HVP堿味較重不利于直接使用。微生物發酵法也可將植物蛋白水解，如Aguirre等[10]證實乳酸菌可以水解大豆蛋白，不同種類乳酸菌水解大豆蛋白的氨基酸含量相差較大，目前機理尚待研究。

1.1 酸法水解植物蛋白工藝

酸法水解植物蛋白，最早出現于1866年的瑞士，我國生產開發始于20世紀90年代初[4]。目前主要用鹽酸或硫酸制備aHVP。酸解法中蛋白種類、酸的濃度、固液比、水解時間等條件對水解度有影響。郭青雅等[11]以水解度和谷氨酸含量為指標研究水解工藝，得出開始時鹽酸濃度增大及酸解時間增長，水解度提高，當鹽酸濃度或酸解時間增加到一定水平時，水解度變化不大，而高濃度長時間酸解會破壞氨基酸結構。華婧等[12]以20%濃硫酸溶液溶解適量大豆蛋白，110 ℃水解8 h條件下進行實驗，發現采用不同固液比得到的水解度均較高，增大固液比對水解度影響很小，故選擇較小固液比進行水解，以減少酸的用量并使水解液風味較好。Jarunrattanasri等[13]采用0.5 mol/L HCl溶液水解米糠蛋白，95 ℃條件下水解12 h，水解度為13.3%；水解36 h的水解度為24%；表明隨酸解時間的增長，水解度增大。表1匯總了報道的酸法水解不同植物蛋白工藝。

表1 文獻報道的酸法水解植物蛋白工藝Table 1 HVP preparation technologies by acidolysis of vegetable protein reported in the literature

酸解植物蛋白法歷史悠久，成本低水解度高，但易破壞氨基酸與多肽的結構，且存在產生氯丙醇的食品安全問題。故近年來報道的多為HVP酶解法水解工藝。

1.2 酶法水解植物蛋白工藝

常使用已經工業化的蛋白酶對植物蛋白進行酶解。按照作用位點，蛋白酶可分為內切酶和外切酶。根據其來源不同可分為動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶三大類。如表2所示，其中微生物蛋白酶種類豐富，來源廣泛。利用遺傳工程技術使微生物菌株獲得改良，增加蛋白酶種類，可使酶解植物蛋白技術不斷得到發展[4]。文獻報道的酶法水解植物蛋白工藝見表3。

表2 植物蛋白水解常用酶種類Table 2 Enzymes used for hydrolysis of vegetable proteins

不同酶的水解條件不同。酶解條件一般為溫度45～65 ℃，pH 5.0～9.0，酶解時間2～24 h。往往隨加酶量升高水解度開始增大，一定加量后水解度趨于平緩。加酶量過高時，水解產物的風味還會受到酶異味的影響。隨時間的延長水解度增加，達到最大值后，水解度會與時間呈負相關。底物濃度過高時，因體系粘稠，底物與酶接觸不充分，水解度會降低。由于酶易受環境影響失活，選擇最適pH下酶解，水解度高。

目前，以小麥、花生、大豆、菜籽等植物蛋白為原料的酶解工藝報道較多，其他蛋白如玉米、蘑菇等蛋白的酶解工藝也有些研究。同一植物蛋白采用不同酶，其較佳酶解條件及獲得的水解度及酶解產物組成不同。武彥文等[44]使用木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、復合胰酶、復合蛋白酶水解大豆粕蛋白，結果表明復合胰酶水解度最高。Kim等[49]的實驗結果也證實這一點，并報道最佳水解條件為：復合胰酶2%，固液比1:8，50 ℃下酶解24 h。Kong等[20]酶解小麥蛋白，比較堿性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶的酶解效果，發現采用堿性蛋白酶時蛋白質回收率和水解度顯著高于采用其他酶，堿性蛋白酶酶解的最佳條件為：蛋白溶液5%，酶與底物比1:100，60 ℃，pH 8.6，酶解6 h。劉英麗等[36]酶解高溫花生粕粉，比較堿性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的酶解效果，發現采用堿性蛋白酶時水解度和DPPH清除率（衡量抗氧化性能的參數）均最高，最佳條件為：蛋白7%，酶加量2%，65 ℃，pH 8.0，酶解4 h。

采用酶法制備HVP存在酶解液有苦味問題。蛋白質水解過程中，部分疏水基團隨著蛋白結構的改變而暴露，從而酶解液出現苦味。內切酶如風味蛋白酶，從肽鏈中間特殊作用位點進行切斷，而外切酶從多肽鏈的末端切斷。具有苦味的多肽稱為苦味肽，外切酶使苦味肽徹底降解為氨基酸后，苦味可消失，故使用外切酶可降低酶解液的苦味。僅使用外切酶時水解度低，采用外切酶與內切酶結合的復合酶解法進行酶解，可達到降低產物的苦味又不損失水解度。復合酶解包括外切酶與內切酶二者分步酶解及二者同

時酶解兩種方式。張繼賢等[70]酶解鷹嘴豆蛋白，首先進行堿性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等的單一酶解，再采用堿性蛋白酶與風味蛋白酶進行復合酶解，獲得最佳水解條件為：第一步，蛋白濃度1%，堿性蛋白酶2000 U/g，55 ℃，酶解2.5 h；第二步，使用風味蛋白酶4000 U/g，55 ℃，酶解3 h。劉佳等[41]發現使用風味蛋白酶酶解牛肝菌時鮮香味增加，苦味降低，然后考察了風味蛋白酶分別結合木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶的復合酶解效果，得出較佳條件為：同時添加10 萬U/g風味蛋白酶和80 萬U/g木瓜蛋白酶，加量0.3%；料水比1:7（g /mL），50 ℃，pH 6.0，酶解4 h，此時水解度較高及酶解液的風味較好。此外，Zhang等[57]研究表明，在水解過程中外加谷氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸可增加鮮味、降低苦味，外加精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸具有更高的抗氧化活性。

表3 文獻報道的酶法水解植物蛋白工藝Table 3 Reported HVP preparation technologies by enzymatic hydrolysis of vegetable protein in literature

為了克服酶法的水解度低及酸法產生氯丙醇的缺陷，酸法與酶法二者結合制備HVP具有更好前途。例如，史亞靜等[83]選用酸酶結合法制備安全、利用率高的水解液，第一步：脫脂大豆粕料液比為1:10，木瓜蛋白酶0.15%，60 ℃，酶解1 h；第二步：風味蛋白酶0.15%，50 ℃，酶解2 h，此時水解度為10.46%；第三步：3 mol/L鹽酸，60 ℃，酸解1 h，獲得水解度較高34.87%、氯丙醇含量較低（0.3 mg/kg）的水解液。

2 HVP中檢測的風味物質

HVP風味主要由其所含的氨基酸與還原糖發生美拉德反應及脂肪酸發生氧化降解反應產生。表4列出了迄今為止從aHVP與eHVP中檢測的主要風味物質，共99種化合物，包括含硫化合物9種，含氮雜環化合物22種，含氧雜環化合物9種，醛類16種，酮類8種，醇類6種，酸類15種，酯類4種，酚類6種，其他類4種。其中，有31種化合物采用氣相色譜-質譜聯機（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）分析檢測到，68種化合物采用氣相色譜-嗅聞法（Gas Chromatography-Olfractometry，GC-O）檢測到。

表4 HVP中檢測的風味物質Table 4 Flavor compounds found in HVP

續表 4

根據稀釋法GC-O （Aroma Extract Dilution Analysis/GC-O，AEDA/GC-O）分析的稀釋因子（Flavor Dilution Factor，FD）或根據計算得到的化合物氣味活性值（Odor Activity Value，OAV）可確定揮發性風味化合物對總體香氣的貢獻。Lopez等[39]采用稀釋法GC-O分析未成熟的白色雙孢蘑菇蛋白酶解物，發現2-乙?；邕?、3-(甲硫基)丙醛、2,5-二甲基-4-羥基-3（2H）呋喃酮、3-羥基-4,5-二甲基-2（5H）-呋喃酮、苯乙醛、鄰氨基苯乙酮、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、香草醛FD值較大，為重要風味化合物。Kaewka等[5]GC-MS分析酸解的米糠蛋白HVP，發現OAV≥1的包括糠醛、2-甲氧基-6-甲基吡嗪、己醛、香草醛，為重要風味化合物。

水解的蛋白種類對HVP風味有較大影響。Aaslyng等[54]發現2-乙?；秽谒峤獯蠖沟鞍字械暮浚?215 ng/100 mL）顯著高于酶解大豆蛋白（20 ng/100 mL），而2-甲氧基苯酚相反，酶解大豆蛋白（1968 ng/100 mL）顯著高于酸解大豆蛋白中的含量（116 ng/100 mL）。脂肪醛、酮、醇、酸、酯來源于脂質氧化反應，植物蛋白中的甘油三酯水解生成脂肪酸，經自動氧化與熱氧化產生小分子化合物。其中，醛類是主要的氧化產物，如亞油酸氧化產生的（E,E）-2,4-癸二烯醛，可進一步分解生成對風味有重要影響的乙醛、戊醛等短鏈脂肪醛和（E）-2-辛烯醛等烯醛[90]。2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛等帶有支鏈的醛和苯乙醛分別來源于纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的Strecker降解反應[7]，對HVP風味往往有重要貢獻，而2-甲基丙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、苯乙酸為上述醛的氧化產物。由于酸解法溫度高，意味著酸解HVP中產生的支鏈醛或苯乙醛的含量可能高，但實驗表明兩種水解方法產生的含量并無顯著差異，可能由于pH等其他反應條件也會有影響造成[54]。直鏈酮如2-丁酮、6-甲基-2,4-庚二酮由脂質氧化降解反應產生，但3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二酮由美拉德反應中糖降解產生。醇類化合物中，苯乙醇為苯乙醛還原產物，其他化合物由脂質氧化降解反應產生，如具有蘑菇風味的1-辛烯-3-醇主要由亞油酸氧化降解產生[91-92]。內酯類化合物一般具有水果香、甜香，由γ-羥基酸環化脫水形成[92]。酚類化合物和其他化合物可能是由酶或植物蛋白帶入，其中原料中含有的木質素或酚酸類物質發生降解可產生酚類化合物。

3 HVP在熱反應肉味基料制備中應用

3.1 熱反應肉味基料制備工藝

表5匯總了文獻報道的以HVP為原料制備熱反應肉味基料工藝。原料配方及熱反應條件對熱反應肉味基料風味有重要影響。劉立新等[100]通過正交試驗得出，溫度與時間對熱反應基料風味的影響均為開始時呈正相關，隨著溫度升高或反應時間延長變成負相關。毛善勇等[14]采用響應面法設計實驗得出溫度過高時熱反應產生燒焦味和糖漿味，而反應液pH升高到8時產生氨味。Chen等[23]研究發現，HVP進行脫酰胺處理可使熱反應肉味基料風味更豐富。彭秋菊[93]通過正交試驗發現HVP粉與酵母抽提物對烤肉風味影響相近，但兩種原料的熱反應工藝配方有明顯差別，在反應體系中添加黑胡椒粉、蒜粉、孜然粉等香辛料，可使烤肉味濃郁，風味飽滿。曾慶祝等[101]采用花生粕蛋白先發酵后酶解的方法，提高蛋白利用率的同時，使制備的肉味基料風味醇厚鮮香。冷云等[95]測定得出酶解大豆蛋白中含有大量苯丙氨酸、亮氨酸、精氨酸，又補充半胱氨酸、硫胺素、維生素C進行熱反應，使豬肉香味純正濃郁。

表5 熱反應肉味基料制備工藝Table 5 Reported preparation technologies of thermal reaction meat stock

由表5可知，由于酶法水解植物蛋白產物溫和，氨基酸和多肽保留較好，制備熱反應肉味基料時，多采用了eHVP。eHVP是氨基酸與多肽的混合體系，eHVP對制備肉味基料的影響與其水解度存在密切關系，水解度不同，所含的氨基酸和多肽種類和含量不同，熱反應后風味不同。張繼賢等[98]研究表明，不同水解度的酶解鷹嘴豆蛋白液為原料，制備的熱反應肉味基料風味差異較大，其中水解度在23.03%～26.02%范圍內的酶解液制備的肉味基料香氣豐富，肉味濃郁。eHVP中肽的分子量分布也有影響，一般分子量越小，肽鏈越短，反應程度越高，揮發性化合物的數量越多[31]。Yu等[59]使用豆粕酶解物制備熱反應肉味基料，發現使用分子量為1～3 kDa的多肽組分制備的肉味基料鮮味和肉味最佳，其次為＜1 kDa多肽組分。

此外，受熱條件下酶解液自身產生的風味物質對熱反應肉味基料風味的影響不容忽視。Lotfy等[40]對比了微波加熱與傳統加熱時酶解物的風味差異及影響，結果顯示傳統加熱法檢測出44 種化合物，而微波加熱法僅檢測出28種，而某些關鍵肉味化合物如2-甲基-3-呋喃硫醇，通過傳統加熱法檢測峰面積占10.07%，小于微波加熱法（13.37%）。

總之，已報道的熱反應工藝配方主要為以HVP為主體的美拉德反應前體物構成，發生熱反應時僅產生基礎肉香味，但無特征肉風味或特征肉風味很弱。在真實的肉類風味中，肉中動物脂肪氧化產生大量醛酮類羰基化合物，這些羰基類化合物構成了不同種動物肉的特征風味。因此，人們采用適當添加油脂的方法提升特征肉風味，如劉立新等[100]以酸解植物蛋白為原料，添加葵花籽油，制備類似牛肉香味。植物油與動物脂肪在脂肪酸組成及一些微量組分（如植物油中含有多酚類）方面有較大差別，故如何將植物油定向氧化獲得類似于動物脂肪的氧化產物，是制備具有特征性肉香味的肉味基料的關鍵所在。另外，植物油還含有大量具有“青草味”的物質（如己醛），因此，如何使“青草味”減弱甚至消失是植物油定向氧化過程中要解決的首要問題[102]。

3.2 熱反應肉味基料檢測到的風味物質

表6匯總了迄今文獻報道的以HVP（主要為eHVP）為主要原料制備的熱反應肉味基料中風味物質，共117種化合物，包括含硫化合物25種，含氮雜環化合物20種，含氧雜環化合物9種，醛類17種，酮類9種，醇類12種，酸類12種，酯類5種，酚類3種，其他類5種。GC-MS鑒定出74種化合物，GC-O鑒定出43種化合物。

表6 熱反應肉味基料中檢測到的風味物質Table 6 Flavor compounds found in thermal reaction meat stock

續表 6

續表 6

與表4相比，由于熱反應時添加了含硫氨基酸或硫胺素，造成檢測出的含硫化合物種類數顯著增加。含硫化合物對肉類風味有重要貢獻，往往氣味閾值低，GC-O檢測時有較高FD值。其中3-甲硫基丙醛和二甲基二硫醚來源于蛋氨酸Strecker醛降解[40,68,74]，2-甲基-3-（甲基二硫基）呋喃，由半胱氨酸的美拉德反應產生的2-甲基-3-呋喃硫醇再與甲硫醇反應形成[105]。含氮雜環化合物由美拉德反應產生，脯氨酸與還原糖反應可產生2-乙?；?1-吡咯啉[8,40]。吡嗪類化合物具有烤香，堅果香，可通過兩分子α-氨基酮縮合形成，且這種縮合反應堿性pH下易于進行[55,68,78]。崔春等[4]研究表明，aHVP由于主要由氨基酸組成，制備的肉味基料肉味突出；而eHVP含有游離氨基酸和大量的多肽，制備的肉味基料烤香明顯，這與研究發現[106]的氨基酸組分對于產生含硫化合物貢獻較大，而短肽發生美拉德反應易產生吡嗪類化合物的研究結論相一致。

含氧雜環化合物，如2-乙?；秽?、糠醛、甲基麥芽酚，普遍具有焦糖香。乳糖是2-乙?；秽淖顑炃绑w[78]，糠醛可由戊糖的Amadori產物通過1,2-烯醇化及環化反應產生[78]。甲基麥芽酚可在麥芽糖與氨基酸的加熱過程產生[7]。由于熱反應肉味基料制備中添加了還原糖，含氮雜環、含氧雜環、Strecker醛等產生于美拉德反應的風味物質的含量往往比HVP自身增加，如Aaslyng等[3]對比eHVP熱反應前后風味物質，發現吡嗪類化合物（如三甲基吡嗪）含量顯著上升。

4 結論

本文綜述了HVP制備工藝及以HVP為原料制備熱反應肉味基料工藝的研究現狀及檢測的風味化合物。植物蛋白來源廣泛、價格低廉，以HVP為原料制備的“非肉源”熱反應肉味基料不僅風味復雜多樣，且營養健康、綠色環保，可在如今人口激增帶來的壓力下改善資源短缺及食品安全的問題，符合當今食品工業發展趨勢。未來發展中，通過深入挖掘肉味同源理念中肉香味的形成機理，以植物蛋白水解物（如HVP）構造含有重要肉香前體的食品體系，通過熱反應和調香制備植物性肉味香精，將成為香精香料和食品行業的重要方向。