外源赤霉素調控稻草飼用品質后水稻轉錄因子基因表達譜分析

董臣飛 許能祥 張文潔 顧洪如

摘要：為探索外源赤霉素（GA）調控稻草飼用品質的分子機制，采用Illumina HiSeq 2500平臺的水稻表達譜芯片技術，分析研究生育后期外源赤霉素處理后水稻轉錄因子基因表達譜的變化。GA處理后雜交秈稻兩優培九與其對照有28個基因表達發生明顯變化，其中表達上調的有9個，下調的有19個;表達差異明顯的基因主要屬于亞油酸代謝、α-亞麻酸的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸轉換、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、嘌呤代謝等途徑的基因。GA處理后粳稻品種南粳44有11個基因的表達發生明顯差異，其中9個基因表達上調，2個基因表達下調;差異表達基因主要集中在類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、晝夜節律等途徑上。進一步采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR），驗證4個轉錄因子基因在GA處理后表達變化，與表達譜結果基本一致。

關鍵詞：水稻;赤霉素;轉錄因子;基因表達譜

中圖分類號：S511.01 ? 文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0141-05

稻草飼料化利用是當前秸稈綜合利用研究的熱點。前人對稻草飼用的研究多集中在調制方法上[1-2]，但效果受到稻草理化性狀及機械設備等因素的限制。通過栽培及遺傳育種措施改善稻草飼用品質是提高稻草飼用率的簡易方法，但目前這方面的研究較少。在改善稻草飼用品質的農藝措施中，施用外源赤霉素（gibberellic acid，GA）是一種有效方式。前期研究表明，水稻（Oryza sativa）生育后期進行外源GA處理能增加收獲時稻草的綠葉面積，提高稻草中的非結構性碳水化合物（non-structural carbohydrates，NSC）和粗蛋白（crude protein，CP）含量，有效改善稻草飼用品質[3-4]，但缺乏深入的機理研究。

筆者前期研究表明，外施GA后秈稻品種兩優培九和粳稻品種南粳44稻草的飼用品質得到顯著改善，其衰老進程放緩;但是秈稻和粳稻品種間存在顯著差異：兩優培九GA處理組稻草中的NSC和CP含量增加幅度顯著高于南粳44，與之相對應的是葉片中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量顯著低于對照組，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性顯著高于對照，且其酶活性增加幅度高于南粳44，葉片中的GA含量和GA/脫落酸（ABA）的值均顯著高于對照組，且高于南粳44。這說明水稻生育后期噴施外源GA能顯著改善稻草飼用品質，主要通過減少MDA的積累量，提高SOD和POD活性，提高內源GA含量及GA/ABA的值來實現，且對衰老進程較快的秈稻品種兩優培九的效果優于粳稻品種南粳44[5]。但GA是如何改變水稻基因表達，對生理性狀產生影響的分子機理有待進一步探究。

本研究在前期外源GA對稻草飼用品質及水稻內源激素含量和衰老相關生理指標影響的基礎上，采用兩優培九和南粳44這2個不同類型水稻品種為試驗對象，于開花后15 d噴施45 g/hm2 GA，在處理后采集水稻葉片樣品，分析外源GA處理對水稻轉錄因子基因表達譜的影響，以期為揭示外源赤霉素調控稻草飼用品質的分子機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

利用江蘇地區生產中推廣應用的2個不同類型優質水稻品種（雜交秈稻兩優培九、早熟晚粳南粳44）進行試驗。

1.2 試驗設計與田間管理

試驗于2015年在江蘇省農業科學院水稻試驗田進行。于2015年5月10日播種，6月13日插秧。采用隨機區組設計，每個處理3次重復，每小區10行，每行10株，1穴1株，行株距為30 cm×20 cm。按照常規水稻進行肥水管理。

1.3 測定內容及方法

水稻開花后挑選長勢一致的主莖倒1葉掛牌，在水稻開花后15 d（9月8日）上午噴藥，GA噴施濃度為45 g/hm2。噴藥后14 d（9月22日，即開花后29 d）取樣。采集主莖倒1葉，用錫箔紙包好放入液氮罐中冷凍保存。樣品質檢合格后，構建表達譜測序文庫，基于Illumina技術測序平臺，進行雙端測序（測序平臺為Illumina HiSeq2500;測序方式為PE100）。采用與表達譜測序相同的RNA進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）分析驗證芯片的試驗結果?；虮磉_譜分析及實時熒光定量PCR驗證均委托廣州銳博生物科技有限公司進行測定。

2 結果與分析

2.1 赤霉素處理后雜交秈稻顯著差異表達基因轉錄譜

圖1是兩優培九CK的3個重復樣本以及GA處理3個重復樣本中都表達差異的基因匯總，其中紅色區域表示表達上調基因，綠色區域表示表達下調基因，黑色表示表達不變。兩優培九開花后 15 d 噴施GA處理后，對照組和GA處理組有28個基因表達發生顯著變化，其中表達上調的有9個，下調的有19個。

如圖2所示，表達差異顯著的基因主要屬于亞油酸代謝、α-亞麻酸的代謝、戊糖和葡萄糖醛酸轉換、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、嘌呤代謝等途徑。

2.2 赤霉素處理后粳稻品種南粳44顯著差異表達基因轉錄譜

由圖3可知，粳稻品種南粳44 GA處理后有11個基因的表達差異顯著，其中9個基因表達上調，2個基因表達下調。如圖4所示，表達差異顯著的基因主要屬于類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、晝夜節律-植物等途徑。

2.3 實時熒光定量PCR驗證

在表達差異顯著的基因中選取植物激素信號轉導相關基因Os03t0402800[第3號染色體（chr03）：16407695～16410007]和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）及淀粉和蔗糖代謝相關基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100[第2號染色體（chr02）：343057～346875]進行實時熒光定量PCR驗證;括號中數字表示染色體上的位置。實時熒光定量PCR驗證所用材料與用于表達譜測序的材料及處理方式完全一樣。對其結果進行分析，兩優培九中Os03t0402800基因表達量在GA處理后明顯升高，而南粳44中該基因表達量在GA處理后反而下降;兩優培九和南粳44中Os03t0181100在GA處理后基因表達量均下降，但差異不明顯;兩優培九和南粳44中的Os03t0757900在GA處理后均明顯升高;兩優培九中Os02t0106100在GA處理后小幅下降，而南粳44中卻明顯升高，這些結果與表達譜測序結果基本一致（圖5）。

兩優培九對照和GA處理共同表達差異的12個基因是Os04t0650750、Os01t0186950、Os01t0186900、Os01t0556650、Os01t0850550、Os04t0650700、Os05t0312600、Os02t0808601、Os03t0757900、Os05t0161500、Os10t0509401、Os05t0380900;南粳44對照和GA處理共同差異表達的4個基因分別是Os08t0386200、Os04t0423400、Os01t0838350和Os09t0522000;兩優培九和南粳44對照和GA處理組共同差異表達基因只有1個，是位于第6號染色體（chr06）的2162738～2165150區間的Os06t0141200。

3 討論

前期研究表明，外源GA改善稻草飼用品質的生理機制主要通過有效減少葉片中MDA的積累，提高水稻葉片的SOD和POD活性來實現[5]。在苜蓿上使用GA有類似效果[6]，脂質過氧化產物MDA含量是脂質過氧化程度的重要指標之一。它可引起生物大分子的變性或降解及生物合成的降低，破壞細胞結構[7]。研究表明，GA能有效抑制水稻旗葉MDA含量的上升，降低旗葉的脂質過氧化速度，減少MDA對細胞結構的破壞，對延緩細胞衰亡有一定作用[8]。

本研究結果表明，外源GA處理后，秈稻和粳稻品種基因表達譜的變化存在一定差異。水稻基因組中編碼轉錄因子的基因數有1 306個。這些轉錄因子功能復雜，參與了包括植物的生長發育、形態建成、生物和非生物脅迫以及植物激素的代謝和傳導等各個方面的調控作用。本研究中兩優培九和南粳44對照轉錄差異的基因包含有與植物激素信號轉導的相關基因Os03t0402800（chr03：16407695～16410007）和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）（圖1至圖4）。而筆者前期研究表明，外源GA處理對兩優培九和南粳44的作用效果不同，GA處理對衰老進程慢的粳稻品種南粳44延緩衰老、改善稻草飼用品質的效果不如對衰老進程較快的秈稻品種兩優培九影響效果顯著[5]。這意味著兩優培九和南粳44本身存在激素代謝差異，而筆者前期結果驗證了這一推論：外源GA處理后，水稻葉片中的內源激素含量發生了顯著變化，秈稻和粳稻品種間存在顯著差異，兩優培九對照的GA含量和GA/ABA的值在2次取樣時均顯著低于南粳44對照，ABA含量高于南粳44，兩優培九GA處理的GA含量和GA/ABA的值在2次取樣時均極顯著高于對照（P<0.01），變化幅度高于南粳44[5]。本研究還發現，GA調控后淀粉和蔗糖代謝相關基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100（chr02：343057～346875）發生變化（圖1至圖2），而前期研究表明在水稻生育后期進行外源GA處理能有效提高稻草中的非結構性碳水化合物（NSC）含量[4]，這意味著Os03t0757900和Os02t0106100基因可能參與了稻草中NSC代謝積累的過程。

本研究中GA處理后植物激素信號轉導相關基因Os03t0402800（chr03：16407695～16410007）和Os03t0181100（chr03：4248884～4249820）及淀粉和蔗糖代謝相關基因Os03t0757900（chr03：31315908～31318366）和Os02t0106100（chr02：343057～346875）的轉錄因子表達發生顯著變化，但其參與的GA處理后基因調控網絡尚不清楚，而這對深入了解轉錄因子的功能及其在調控中扮演的角色至關重要。今后筆者將進一步用RNA干擾、蛋白互作等技術進一步研究水稻響應GA處理過程的分子機制及相互間復雜的調控網絡，將轉錄因子基因應用于稻草飼用品質的改善中，以期綜合提高稻草飼用品質。

4 結論

外源赤霉素能有效調控稻草飼用品質。兩優培九經GA處理后，其對照和GA處理有28個基因表達發生顯著變化，其中表達上調的有9個，下調的有19個。表達差異顯著的基因主要屬于亞油酸代謝、α-亞麻酸的代謝、戊糖、葡萄糖醛酸轉換、植物病原物相互作用、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、嘌呤代謝等途徑。粳稻品種南粳44經GA處理后有11個基因的表達發生顯著差異，其中9個基因表達上調，2個基因表達下調。差異表達基因主要集中在類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、植物晝夜節律等途徑上。

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