熱激聯合牛蒡抗熱保護劑對益生菌奶粉中益生菌噴霧干燥活性的影響

崔莉 李瑩 馮進 柴智

摘要：提高益生菌抗熱性的研究一直是工業化噴霧干燥生產益生菌奶粉的熱點與難點，研究益生菌 FM-LP-4 的熱激預處理條件，優化菌體經熱激預處理后使用牛蒡復合抗熱保護劑的噴霧干燥工藝。結果表明，適宜進行熱激的益生菌培養時間段為10～11 h，最適熱激溫度為55 ℃，熱激時間為25 min。噴霧干燥的最優工藝為：出口溫度80 ℃，進口溫度170 ℃，進料速率0.8 L/h，此時活菌數為4.64×109 CFU/mL。熱激菌體加牛蒡復合抗熱保護劑經優化的噴霧干燥工藝獲得益生菌奶粉，其中益生菌活菌數比對照提高約1個數量級。

關鍵詞：牛蒡;益生菌;熱激;噴霧干燥;奶粉

中圖分類號：TS252.51 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）10-0166-04

中國已經趕超日本、美國成為全球第一大奶粉消費國。隨著人們營養保健意識的不斷提高和消費觀念的轉變，具有營養保健功能的高端乳制品日益成為新的消費引擎。益生菌奶粉為含有益生菌的奶粉，具有改善人體腸道宿主環境的作用。目前，我國市場上高檔的功能性益生菌乳制品已出現，然而，大多以發酵乳的形式出現，需冷鏈運輸，且保質期短。功能性益生菌奶粉的研制，突破了運輸壁壘，擴大消費區域，具有廣闊的市場化前景。

益生菌奶粉常采用將奶粉和凍干益生菌粉混合的方法制備，冷凍干燥的高成本是其瓶頸。若能采用噴霧干燥1次制備益生菌奶粉，則有望大幅降低成本。噴霧干燥過程對益生菌帶來脫水、氧化和熱損傷，造成活菌數大量下降。有學者提出，多種方法來提升噴霧干燥益生菌的活性，主要有加強對細胞結構的保護、提升益生菌的外界應激抗性，優化噴霧干燥參數，篩選應用抗熱保護劑等[1]。益生菌在外界應激下會生成應激蛋白用于修復受損細胞，提升菌體應激抗性。熱激處理是利用上述特性，通過模擬外界應激條件以增加菌體對應激環境的耐受能力，是一種較常用的提升菌體耐熱能力的途徑。

噴霧干燥抗熱保護劑的篩選已成為相關學者關注熱點，合適的保護劑能有效提高益生菌在干燥、儲藏和體內消化過程等嚴苛環境下的存活率。Chaikham等研究發現，益生元（菊糖、木糖和低聚果糖等）對益生菌的耐熱性有保護作用[2]。牛蒡塊根富含菊糖、酚酸、黃酮、牛蒡苷及多種維生素等營養功能成分?，F代醫學證明，牛蒡具有抗氧化、抑菌、抗疲勞、免疫調節、保護肝臟[2-3]、促進益生菌生長等多種功效[4-5]。雷張騰將菊糖作為保拉迪酵母的復合凍干保護劑成分，并認為菊糖中的羥基通過與細胞膜磷脂和蛋白質以氫鍵結合，對菌體起到保護作用[6]。崔莉等通過單因素和正交設計優化獲得FM-LP-4牛蒡復合抗熱保護劑配方（豐縣牛蒡粉2.0%、葡萄糖4%、沛縣牛蒡粉2.0%），菌體在復合保護劑保護下經75 ℃熱處理10 min后活菌數為2.12×106 CFU/mL[7]。本研究在獲得保護劑配方的基礎上，探討熱激處理和噴霧干燥工藝參數優化對益生菌奶粉中益生菌FM-LP-4的耐熱保護作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

副干酪乳桿菌FM-LP-4為研究室保藏。試驗時間為2019年7月12日至8月17日。明膠，用PBS溶解后滅菌備用，使用前水浴加熱溶解。蔗糖和甘油：需經微孔濾膜過濾。陸橋MRS肉湯培養基。MRS固體培養基，在液體培養基的基礎上加入1.5%瓊脂。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-ID 型凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司;上海第三分析儀器廠;高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠;H1850R型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;HH-4 數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;HYG-A全溫搖瓶柜，太倉實驗設備廠;FW100高速萬能打粉機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴大培養 將副干酪乳桿菌 FM-LP-4 凍干菌種接入液體培養基中，34 ℃振蕩培養24 h，活化2～3次?；罨玫姆N子液以5%的接種量接種于MRS 液體培養基中，同樣條件擴大培養后菌液離心取菌泥，用無菌生理鹽水或牛奶沖洗，制成活菌數為1010 CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 活菌數測定 按照GB 4789.35—2010，采用稀釋涂布平板計數法。

1.3.3 牛蒡復合抗熱保護劑的制備 牛蒡超微粉的制備：將豐縣和沛縣牛蒡于60 ℃下干燥4 h，至水分6%以下，經粉碎機超低溫粉碎，過325目篩得牛蒡超微粉。牛蒡復合抗熱保護劑配方為豐縣牛蒡粉2.0%、葡萄糖4%、沛縣牛蒡粉2.0%。

1.3.4 抗氧化能力的測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考Shen 等的方法[8]，略做改進。1 mL經熱激預處理菌液溶解到9 mL 95% 乙醇溶液，取2 mL樣品混合溶液加 2 mL 0.16 mmol/L DPPH 溶液，25 ℃ 水浴加熱 0 min，在517 nm處測試樣吸光度（Di），用蒸餾水代替上述體系中樣品混合溶液測得空白吸光度（D0），用 95% 乙醇代替上述體系中 DPPH 溶液。測得樣品本底吸光度（Dj），清除率=1-（Di-Dj）/D0×100%，其中D0取0.552。

1.3.4.2 OH自由基清除能力的測定 參考Shen等的方法[8]，略做改進。1 mL經熱激預處理菌液溶解到9 mL 95%乙醇溶液，取4 mL樣品混合溶液加入8.8 mmol/L H2O2、9 mmol/L FeSO4 和 9 mmol/L水楊酸各 0.5 mL，混勻，37 ℃水浴加熱30 min，在 510 nm 處測定吸光度（Di′），用蒸餾水代替體系中樣品混合溶液，測得空白吸光度（D0′），用蒸餾水替代HO溶液，測得樣品本底吸光度（Dj′），清除率=1-（Di′-Dj′）/D0′×100%，其中D0′取0.602。

1.3.4.3 Fe3+還原力的測定[9] 1 mL經熱激預處理菌液溶解到9 mL 95% 乙醇溶液。取2 mL樣品混合溶液加入10 g/L鐵氰化鉀溶液和 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值6.6）各2 mL，于50 ℃ 保溫 20 min，加入2 mL 1 g/mL 三氯乙酸溶液，混勻，3 000 r/min 離心10 min，取 2 mL 上清液，加入 2 mL 蒸餾水和 0.4 mL 1 g/L 三氯化鐵溶液，室溫反應10 min，于700 nm 處測定吸光度。

1.3.5 熱激條件

1.3.5.1 熱激菌體培養時間的選擇 根據FM-LP-4生長曲線，選擇對數期菌數較多的時間段作為熱激菌體培養最佳時間段。

1.3.5.2 耐熱曲線 選擇45、50、55、60 ℃為熱處理溫度，將益生菌液在上述溫度下水浴，每隔5 min測定活菌數，以熱處理時間為橫坐標、活菌數為縱坐標繪制其耐熱曲線。

1.3.5.3 不同熱激條件對菌體抗氧化活性的影響 在選定的熱激條件下對FM-LP-4熱激處理，測定抗氧化活性變化，選擇菌體抗氧化活性較高的熱激條件。

1.3.6 噴霧干燥條件對益生菌奶粉中益生菌活菌數的測定的影響 經熱激預處理菌液離心得菌泥，溶解于不同濃度含牛蒡復合抗熱保護劑無菌牛奶中，采用正交試驗L9（34）對出口溫度（A）、進口溫度（B）、進料速率（C）3項噴霧干燥工藝參數對益生菌奶粉中益生菌活菌數的測定的影響進行檢測，正交試驗因素水平見表1。試驗結果采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，以篩選出最佳噴霧干燥條件。

1.3.7 數據統計分析 用Microsoft Excel 1997—2003進行數據整理和作圖分析，采用SAS V8統計進行方差分析，并應用t檢驗進行樣品間的顯著性差異分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 FM-LP-4亞致死熱激條件確定

2.1.1 最佳耐熱時間的選擇 從圖1可以看出，10～12 h 的FM-LP-4生長速率最快，此時LA達到對數生長期，并在培養12 h的時候達到了菌數的最大值，Corcoran等認為，對數生長期的菌體較穩定生長期的菌體可塑性強，應對脅迫情況提升抗逆性好，可以很快調整體內代謝途徑以適應不利環境[10-11]。張書猛等研究比較嗜酸乳桿菌在不同菌體生長期的耐熱性，提出其在穩定期即培養11 h時，抗熱性能較優[12]。結合相關研究，選擇10～12 h 為熱激菌體培養最佳時間段。

2.1.2 FM-LP-4耐熱曲線 從圖2可以看出，FM-LP-4在60 ℃條件下處理15 min基本失活。在45、50、55 ℃條件下，處理25 min時，菌數均有較明顯的下降，但依然保持較好的存活率。胡榴榴研究發現，干酪乳桿菌1.12.8 在50 ℃熱處理25 min后，活菌數下降不到1個數量級;60 ℃熱處理 25 min，菌體數量下降了約1個數量級[13]，因此確定60 ℃ 25 min 為其熱激處理條件。

L. plantarum 299v在噴霧干燥前經過49.5 ℃的亞致死溫度處理30、60 min于室溫下貯藏180 d，其存活性顯著增強，并推測熱應激引起的保護作用有可能是生成了熱休克蛋白[14]。L.acidophilus以 50 ℃、L. rhamnosus以 52.5 ℃亞致死預處理12 min后，均能夠耐受隨后的92 ℃的噴霧干燥出口溫度，而通常乳酸菌能夠耐受的溫度為 85～90 ℃[15]。經過亞致死溫度（52 ℃，15 min）預處理后再噴霧干燥將使L. casei Nad、L. plantarum 8329的菌數下降0.16、0.49 lg（CFU/mL），而未經預處理直接噴霧干燥其菌數下降0.85、0.95 lg（CFU/mL）[16]。

2.1.3 不同熱激溫度對抗氧化活性的影響 從表2可以看出，FM-LP-4在55 ℃條件下處理25 min時，各項抗氧化指標均高于50 ℃。張書猛等選取40、45、50、55、60 ℃進行30 min熱激處理，研究其熱激后的菌數變化，發現在45 ℃時菌體具有較高的活菌數，存活率也較高，并且具有較好的發酵性能[12]，所以選擇45 ℃作為熱激溫度。從圖2、表2可以看出，FM-LP-4在55 ℃條件下的存活率較高，而且抗氧化活性最高，推測其經熱激休克后產生了熱適應，故選擇55 ℃處理25 min為最佳熱激條件。

2.2 含FM-LP-4 奶粉的噴霧干燥工藝確定

2.2.1 噴霧干燥正交試驗 含FM-LP-4 奶粉的噴霧干燥工藝參數L9（34）正交試驗因素水平取值及結果見表3。經直觀分析比較3個因素的極差R值可知各因素對噴霧干燥后菌存活的影響程度為A>B>C，由各因素的均值大小可知最佳組合為A1B3C3，即噴霧干燥工藝參數為：出口溫度 80 ℃，進口溫度170 ℃，進料速率0.8 L/h。

2.3 熱激、牛蒡復合抗熱保護劑和噴霧干燥工藝優化及聯合對益生菌抗熱性能的影響

從表4可知，牛蒡復合抗熱保護劑可以提升益生菌的存活率近2倍，熱激聯合牛蒡復合抗熱保護劑則可以將益生菌的活菌數提高約1個數量級。

3 結論

FM-LP-4適宜進行熱激的培養時間段為 10～11 h，最適熱激溫度為55 ℃，熱激時間為 25 min。含FM-LP-4益生菌奶粉噴霧干燥的最優工藝為：出口溫度80 ℃，進口溫度170 ℃，進料速率0.8 L/h，熱激聯合牛蒡復合抗熱保護處理益生菌經噴霧干燥后活菌數比對照提高約1個數量級。

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