痛風病中藥效用機制研究平臺構建及應用

林志健 黃政凱 王雨 楊婷 張冰

摘要 目的：建立中藥防治痛風病的藥效評價平臺，為評價中藥防治痛風病的藥效特點與作用機制提供技術支撐。方法：集成“成分-疾病”靶標網絡分析、病證結合動物模型、器官模型、細胞模型、分子生物學5個層次，從多層次系統構建中藥防治痛風病的藥效評價平臺。結果：本課題組成功構建了基于尿酸生成與排泄、尿酸鹽沉積以及沉積致炎的“整合論治”痛風病藥效評價平臺。該平臺已進行了中藥菊苣等多個中藥品種的藥效評價研究。結論：該平臺集成了病證結合、整體動物、組織器官以及細胞分子生物學的研究技術，能夠對中藥多成分、多靶點、多層次的整合論治特點進行系統評價，已展現出較好的痛風病防治藥物綜合評價優勢，可為臨床防治痛風中藥的研發提供參考和指導。

關鍵詞 痛風病;中藥;整合論治;藥效研究平臺;應用

Platform Construction and Application of a Research Platform on the Mechanism of Chinese Medicine for Gout

LIN Zhijian，HUANG Zhengkai，WANG Yu，YANG Ting，ZHANG Bing

（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China）

Abstract Objective：To establish a platform for evaluating the efficacy of Chinese medicine（TCM）in the prevention and treatment of gout disease.Methods：Our team integrated 5 modules for the gout disease study，the “component-disease” target network analysis，the animal models of combination of disease and syndrome，the organ models，the cell model and the molecular biological analysis module.A platform for evaluating the efficacy of Chinese medicine in preventing and treating gout was established from a multi-level system.Results：Our team had successfully constructed the drug efficacy evaluation platform based on gout disease induced by uric acid production or excretion，urate deposition and urate induced-inflammation.The platform has been used to evaluate the drug efficacy of Cichorium intybus L.and other Chinese herbal medicines.Conclusion：The platform integrates the research technologies of disease and syndrome，whole animals，tissues and organs，and cell and molecular biology.It can systematically evaluate the characteristics of multi-component，multi-target，and multi-level integrated treatment of traditional Chinese medicine，and has shown good advantages in comprehensive evaluation of drugs for the prevention and treatment of gout，which can provide reference and guidance for the development of Chinese medicines for the prevention and treatment of gout.

Keywords Gout disease; Chinese medicines; Integrated treatment; Pharmacological research platform; Application

中圖分類號：R242文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.007

痛風病是指與高尿酸血癥、尿酸鹽沉積密切相關的進展性代謝疾病，其疾病進程包括高尿酸血癥階段、尿酸鹽沉積階段、急性炎癥階段。據《2019中國痛風診療指南》，中國高尿酸血癥的總體患病率達13.3%，痛風性關節炎發病率達1.1%[1]，臨床治療需求迫切。2019年美國風濕病學會學術年會《2020痛風臨床實踐指南（草案）》突破以往痛風急性炎癥不可進行降尿酸治療的認識局限，率先明確指出痛風性關節炎的治療在抗炎的要同時進行降尿酸干預[2]。然而，目前臨床應用的抗痛風病藥物多為化藥，作用靶點明確，分別以降低血尿酸、抗炎鎮痛為治療目的，雖階段性療效顯著，但缺乏降尿酸、抗炎的整體干預，并均存在不同程度的安全風險[3]，難以滿足痛風病臨床治療需求。因此，契合疾病特點，可整體干預痛風病，且安全性好的藥物研發將是未來痛風病防治的重要方向。

我們在整體觀指導下，探討中醫藥在痛風病的臨床治療中的特點，發現祛濕化濁除痹的治療法可取得較好的臨床療效[4]。研究發現其干預環節不僅涉及高血尿酸的降低[5]、急性炎癥的緩解[6]，亦包括貫穿痛風病進展始終的尿酸鹽沉積的改善[7]，具多環節、多靶點的整合論治優勢。但中醫藥治療往往具有經驗性、實踐性的特點，目前對痛風病類復雜疾病的優勢效用尚缺乏一致性的評價體系。本課題組已從尿酸水平升高、尿酸鹽沉積及沉積致炎三階段，集成“成分-疾病”靶標網絡分析、病證結合動物模型、器官模型、細胞模型、分子生物學5個層次，建立了痛風病中藥效用機制研究平臺。因此，本文以痛風病中藥效用機制研究平臺為核心，圍繞平臺建設思路、模塊構架及應用等方面介紹中藥防治痛風病藥效評價平臺的建設情況，以期為臨床藥物研究提供參考，滿足痛風病臨床治療的迫切需求。

1 平臺建設思路

我們認為痛風病中藥效用機制研究平臺建設應以痛風病的病理過程及中醫藥對痛風病的治療原則為基礎。經過多年的探索，本課題組成功構建了“三階段，五層次”符合中藥特點的痛風病中藥效用機制研究平臺。該平臺切入痛風病發生的整體過程，圍繞血尿酸水平升高階段、尿酸鹽沉積階段以及尿酸鹽沉積致炎3個階段，集成“成分-疾病靶標網絡分析、病證結合動物模型、器官模型、細胞模型及分子生物學”5個層次。該研究平臺能夠體現中西醫對痛風病的病理認知，中醫病證結合的治療思路，以及藥物作用靶點與通路的綜合藥效評價。同時可為中藥單方、復方、有效部位、有效成分等多形式的藥物篩選與藥理藥效及作用機制提供技術支持;可針對藥物防治痛風病的不同階段、不同層面進行藥效評價與機制分析，揭示藥物作用的特點與靶點機制，切實服務于痛風病防治的藥物篩選與評價。

2 研究平臺架構及關鍵技術

中藥防治痛風病藥效評價平臺集多項藥理與生物學研究技術為一體，具體包括“成分-疾病”靶標網絡分析、病證結合動物模型、器官模型、細胞模型、分子生物學，符合痛風病的動態發展與全程干預的藥效評價需求。研究平臺的架構與功能特點見表1。

2.1 成分-疾病靶標網絡計算模塊構建

課題組圍繞痛風病不同病理階段的靶點群，構建了痛風病的潛在靶點庫;同時系統梳理古今文獻構建抗痛風病多個中藥的成分數據庫。利用網絡藥理學、分子對接、成分-靶點相互作用分析、功能注釋、通路富集等生物信息學技術，搭建了成分-疾病靶標網絡計算模塊。如課題組通過同源建模技術構建腸道濃度型核苷轉運蛋白2（Concentrative Nucleoside Transporter2，CNT2）、分子對接技術構建尿酸生成代謝黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD）、腺苷脫氨酶（Adenosine Deaminase，ADA）、鳥嘌呤脫氨酶（Guanine Deaminase，GDA）、尿酸排泄轉運體葡萄糖轉運蛋白9（Glucose Transporter 9，GLUT9）、有機陰離子轉運體1（Organic Anion Transporter 1，OAT1）、有機陰離子轉運體3（Organic Anion Transporter 3，OAT3）及腎臟尿酸鹽轉運蛋白1（Urate-anion Exchanger 1，URAT1）等靶點與菊苣、茯苓等多個中藥及復方的成分-靶點網絡，為開展痛風病藥效評價研究提供有益參考。

2.2 病證結合動物藥理模型構建

課題組利用禽類鵪鶉與人類一樣缺乏尿酸酶，尿酸作為嘌呤代謝的終產物的特點，模擬痛風病重要病因，采用添加酵母浸膏粉配制的高嘌呤食餌進行飲食誘導，建立鵪鶉高尿酸血癥及痛風模型[8-9]。該模型突破和規避了嚙齒類動物具有尿酸酶的技術瓶頸與模型缺陷，成功模擬出痛風病發生發展過程中血尿酸水平升高、尿酸鹽沉積以及沉積致炎的病理特點。該模型具有“病證結合”的特點，在中藥防治痛風病的藥效評價中具有突出優勢，為降低血尿酸、抗痛風藥物的實驗研究及開發提供了穩定可靠的動物模型，已用于多種藥物降尿酸及抗痛風的藥理評價，受到同行的認可，已被國內大型藥理工具書《中藥藥理實驗方法學》《中藥藥效研究思路與方法》《藥理實驗方法學》《痛風病學》收載。

同時，根據中醫對痛風病的認知，觀察“四診”的證候表現，通過計算機軟件輔助的數字化定量分析方法采集模型動物的“四診”信息，成功建立動物模型“四診”客觀化數字化診斷技術[10]。該技術能較好地從環境、飲食等綜合因素模擬臨床病因、辨析模型動物證型，可體現痛風病的病機發展規律。

2.3 離體器官藥理模型構建

課題組切入痛風病發生發展過程中的靶器官，關注尿酸排泄的2個重要靶器官腸道及腎臟，已成功構建大鼠離體腎灌流及腸灌流模型，可排除體內神經-體液因素的干擾，直觀反映藥物在靶器官的藥理效應，觀察靶器官對尿酸排泄轉運的干預效果，并廣泛應用于尿酸排泄及其機制的研究。如大鼠離體腎灌流器官模型，通過檢測灌流液尿酸水平與離體腎臟輸尿管尿液的尿酸水平，計算腎臟尿酸排泄率，實現體內實驗與體外實驗的橋梁銜接，直觀分析中藥小分子化合物對尿酸腎臟排泄途徑的干預作用，包括腎小球濾過、腎小管重吸收、腎小管分泌及重吸收環節，可用于促進腎臟尿酸排泄的藥物的發現和評價[11]。腸道是尿酸的腎外排泄途徑，通過離體腸灌流模型可排除腸道菌群對尿酸分解的干擾，在十二指腸及空腸中部形成腸道灌流回路，持續收集流出灌流液，測定尿酸含量，進而評價尿酸在腸道的排泄過程。離體腎灌流與腸灌流模型綜合模擬了尿酸的排泄過程，在促尿酸排泄藥物的評價中起到重要的技術支持。

2.4 細胞藥理模型構建

課題組圍繞尿酸生成、尿酸排泄、沉積致炎病理環節，構建肝L02細胞模型、腸IEC-6、腸CaCo-2模型、腎HKC及HK2模型、尿酸鹽致巨噬細胞炎癥模型體系，可實現對肝臟尿酸生成代謝、腸道嘌呤吸收、腸道尿酸排泄、腎臟尿酸排泄以及尿酸鹽沉積致炎的藥理觀察與作用靶點機制分析。多種細胞藥理模型綜合運用，在中藥干預腸道嘌呤吸收、體內尿酸代謝、腸道與腎臟尿酸排泄的靶點及機制研究中具有突出優勢。

2.5 分子生物學分析構建

課題組在整體動物模型、器官模型及細胞模型的基礎上，以尿酸生成代謝、尿酸排泄及尿酸鹽沉積致炎靶點群為切入點，結合“成分-疾病靶點”網絡計算結果，利用分子生物學技術手段分析中藥成分對痛風病的疾病靶點的綜合調控與干預，從蛋白及基因調控層面闡釋中藥的作用機制。

該效用機制研究平臺可涵蓋痛風病發生發展過程中血尿酸水平升高、尿酸鹽沉積、沉積致炎的病理特點，同時具有反映中醫證候特征的客觀指標，滿足研究防治痛風病的藥物篩選與藥效評價技術需求。另外，該平臺各層次的應用潛力還體現在與其他藥理基礎研究的聯合分析，如與基因組學、腸道組學、蛋白組學、轉錄組學、代謝組學等現代藥理研究技術的聯合應用。

3 研究平臺應用

3.1 中藥及中藥復方降尿酸功效與機制研究

3.1.1 基于“病證結合”動物模型菊苣及菊苣復方降尿酸效果及機制研究

整體動物模型研究提示，菊苣可從多途徑降低血尿酸水平。菊苣提取物5～15 g/kg劑量下可顯著降低高尿酸血癥大鼠或鵪鶉模型的血尿酸水平[12-14]。高尿酸血癥大鼠模型實驗顯示，其一菊苣提取物能上調空腸和回腸中ATP結合盒蛋白G蛋白亞家族成員2（ATP-binding Cassette of Half-transporter Protein，ABCG2）的mRNA及蛋白表達，使腸道肌酐排泄量及腸道尿酸排泄量明顯升高，促進腸道尿酸排泄;其二菊苣提取物能降低可腎臟中尿酸轉運體URAT1和GLUT9蛋白表達，抑制腎臟尿酸重吸收，從而促進肌酐和尿酸的清除，顯著降低血清尿酸和肌酐水平。高尿酸血癥鵪鶉模型實驗顯示，其一菊苣提取物可顯著抑制肝臟尿酸代謝酶XOD及ADA，減少尿酸的生成;其二菊苣提取物可上調鵪鶉腎臟轉運相關受體OAT1-LIKE、OAT3-LIKE的mRNA表達，促進鵪鶉腎臟尿酸分泌。

本課題組以菊苣復方干預“脾虛濕盛”癥候的高尿酸血癥鵪鶉模型，鵪鶉“四診”表征候改善，表現為糞尿形狀改善，濕中及水分減少，氣味減輕，羽毛光澤、明亮，舌體呈現淡紅色。另外，菊苣顆粒治療鵪鶉高尿酸血癥并腹型肥胖（接近臨床“脾虛痰濕”證）的藥效研究發現，菊苣顆?？捎行Ы档往g鶉血尿酸，并呈現出劑量依賴性，大劑量菊苣顆粒的降尿酸效果優于小劑量。而其機制特點主要體現在菊苣顆?？梢种蒲錢OD活性，減少尿酸的生成，可從尿酸生成代謝環節防治高尿酸血癥[15]。

3.1.2 基于離體器官模型中藥降尿酸活性成分篩選及機制分析

本課題組建立的大鼠離體腎灌流及腸灌流模型在中藥降尿酸研究中提示，菊苣有效成分山萵苣苦素、菊苣萜苷K、菊苣萜苷E、秦皮甲素以及菊苣多糖與其代謝物質可調控腸道尿酸轉運體ABCG2，調控腎臟尿酸轉運體GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3等。在離體腎臟灌流及腸灌流模型中，直觀觀察尿酸經腸道與腎臟途徑的排泄，檢測到腎臟輸尿管流出液與腸道灌流流出液中尿酸含量增高。

3.1.3 基于細胞模型中藥降尿酸活性成分確認及降尿酸機制分析

本課題組建立小腸隱窩上皮細胞（IEC-6）模型，觀察菊苣成分菊苣酸和山萵苣苦素對腸道嘌呤核苷轉運蛋白（CNT2）的影響[16]。IEC-6細胞可內源性表達CNT2，具有生長快速、傳代穩定等特點，具有腸上皮細胞的功能，能較好地模擬正常生理條件下腸道嘌呤核苷的轉運過程。加入0.1 mmol/L菊苣酸后，腺苷底物轉運量顯著減少（P<0.01），推測抑制腸道CNT2靶蛋白的活性從而減少腸道嘌呤吸收可能是菊苣降尿酸作用的機制之一。

3.2 中藥及中藥復方抑制尿酸鹽沉積的藥效特點及機制分析

本課題組建立的高鈣高蛋白飲食誘導的尿酸鹽內臟沉積鵪鶉已用于參苓白術散、菊苣及芹槐的干預研究[17-18]。參苓白術散干預后，鵪鶉狀態逐漸好轉，毛色出現光澤，鵪鶉走動次數增加，舌質逐漸恢復為鮮紅色;腎臟部位的尿酸鹽結晶隨給藥時間逐漸減少，在實驗期間已基本消失。菊苣提取物可顯著緩解腎臟的尿酸鹽沉積狀況，同時表現出顯著的降尿酸效果、能夠顯著降低血清炎性反應因子水平，推測菊苣提取物抑制尿酸鹽沉積的療效可能與促進尿酸排泄相關。芹槐提取物可改善鵪鶉模型病理組織損傷，減少腎臟組織的尿酸鹽沉積，但高劑量芹槐提取物藥效不如低劑量芹槐提取物，與此同時，實驗結果顯示芹槐低劑量組降尿酸效果也優于芹槐高劑量組，提示芹槐提取物治療尿酸鹽沉積存在藥效劑量窗口。

3.3 中藥及中藥復方緩解尿酸鹽沉積致炎的藥效特點、有效成分及機制研究

3.3.1 基于動物模型中藥治療痛風性關節炎藥效特點及機制研究

本課題組通過建立耳廓腫脹、痛風性關節炎等多種炎癥模型，采用醋酸扭體法、熱板反應等疼痛實驗，進行痛風性關節炎的相關藥理研究，研究藥物的抗炎鎮痛作用。本課題組的實驗研究表明，菊苣提取物可抑制關節腔注射尿酸鹽結晶誘導的急性痛風炎癥。通過觀察菊苣為主的二秦菊苓湯對小鼠耳廓腫脹、醋酸扭體反應、熱板反應及痛風性關節炎大鼠關節腫脹度、組織勻漿IL-1水平的影響[19]，證實二秦菊苓湯可抑制二甲苯誘導的小鼠耳廓腫脹、醋酸誘導的小鼠扭體反應，提高小鼠痛閾值，還能干預關節局部炎癥小體NLRP3及IL-1、IL-6與TNF-α介導的炎癥通路，改善痛風性關節炎大鼠的踝關節腫脹從而達到干預痛風的目的。

3.3.2 基于細胞模型中藥緩解炎性反應的有效成分及機制研究

本課題組從硫代乙醇肉湯處理的大鼠腹腔中分離出的巨噬細胞，可用于驗證痛風性關節炎與NF-κB、NLRP3信號通路的病理聯系[20]。經過菊苣提取物和菊苣代表性成分菊苣酸干預后發現，均可降低尿酸鹽結晶誘發巨噬細胞分泌的IL-1β水平，證實了菊苣提取物和菊苣酸的體外抗炎作用。同時經過Western Blot技術分析NF-κB、NLRP3信號通路相關蛋白靶點活性，提示菊苣提取物及菊苣酸可抑制p-p65和NLRP3蛋白表達，通過NF-κB、NLRP3信號通路雙重抑制IL-1β的釋放。

本課題組另從尿酸誘導的氧化應激與“腸-腎”組織炎癥損傷關聯角度進行探索分析，選用腸道上皮細胞Caco2、腎臟上皮細胞HKC塑造高尿酸血癥細胞模型[21]，觀察Caco2、HKC細胞中MDA、IL-6水平。研究結果發現高尿酸狀態下的Caco2、HKC細胞中MDA、IL-6水平均顯著升高，說明高尿酸誘發的炎癥損傷存在著氧化應激的參與。菊苣提取物干預后，可顯著降低Caco2、HKC細胞中MDA、IL-6水平，提示菊苣提取物可抑制高尿酸狀態下氧化應激狀況，改善“腸-腎”組織炎癥損傷。

4 結語與展望

本課題組構建的痛風病中藥效用機制研究平臺可作為痛風病中藥藥效評價及篩選的基礎平臺。該平臺主要包括“成分-疾病”靶標網絡分析、病證結合動物模型、器官模型、細胞模型、分子生物學5個層次，可覆蓋中藥成分驗證研究、整體動物的尿酸代謝、尿酸鹽沉積、致炎情況藥理研究、靶器官對尿酸排泄轉運的干預研究、細胞及分子藥理觀察與作用靶點機制分析等研究過程，貫通痛風病發病全流程，從干預尿酸生成、排泄，尿酸鹽沉積及尿酸鹽致炎多方面系統評價中藥防治痛風病藥效作用及特點，闡明中藥防治機制，可為臨床防治痛風中藥的研發提供參考和指導。

目前，該平臺已對菊苣等中藥防治痛風病的藥效開展評價研究及機制探索，研究結果提示菊苣可從減少尿酸的生成、促進尿酸的排泄以降尿酸，緩解尿酸鹽沉積，抑制尿酸鹽致炎三方面綜合防治痛風病的發生、發展。該平臺為痛風病的中藥開發研究提供合適實驗方法和科學依據等，通過對中藥的藥效進行評價研究，闡明防治痛風病中藥的藥理機制，可為客觀詮釋中藥防治痛風藥效提供科學依據，為抗痛風病中藥的繼承和創新研究提供新思路和新方法，切實服務于臨床痛風病的治療和藥物研發。

隨著痛風病中藥效用機制研究平臺建立，活性成分及其藥理作用將得到充分挖掘，中醫藥防治痛風病研究工作的不斷深入，將進一步推動痛風病病理、藥理研究發展，為臨床提供可滿足痛風病患者需求的優質中藥，為抗痛風病中藥的開發和利用提供更加廣闊的前景。

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（2020-12-10收稿 責任編輯：徐穎）

基金項目：國家自然科學基金項目（U20A20406，81673618）;國家科技重大專項“重大新藥創制”項目（2017ZX09301024）

作者簡介：林志?。?983.05—），男，博士，副教授，執業藥師，碩士研究生導師，研究方向：中藥防治代謝性疾病研究，E-mail：linzhijian83@126.com

通信作者：張冰（1959.08—），女，博士，教授，主任醫師，博士研究生導師，研究方向：中藥防治代謝性疾病研究，E-mail：zhangbing6@263.net